Este protocolo fornece uma metodologia robusta para analisar EVs a nível celular, e uma abordagem prática para uma absorção eficiente de EV e análise de rastreamento de EV. Este método de rotulagem EV elimina a co-precipitação de EVs e corante, melhorando assim os sinais de EV. A captação de EV é medida pela análise volumétrica para distinguir os EVs internalizados dos EVs superficiais.
Os EVs são carga ativa, assim, sua captação permite a transferência de moléculas bioquímicas. Para pesquisas sobre a entrega de medicamentos à base de EV e terapia contra o câncer, essa técnica pode ser uma ferramenta de avaliação. A absorção de EV desempenha um papel na comunicação intercelular e é investigada em diversas áreas de pesquisa, como biologia do câncer, neurociência e entrega de medicamentos.
Este protocolo potencialmente facilita um ensaio eficiente de absorção de EV. Para o isolamento de vesículas extracelulares, ou EVs, injete um mililitro de mídia de cultura celular pré-processada na câmara amostral do dispositivo microfluido baseado em nanofiltração. Para operar o dispositivo, gire o dispositivo na máquina giratória benchtop a 3000 RPM por 10 minutos.
Após girar, remova o fluido da câmara de resíduos por pipetação ou aspiração, em seguida, repita este procedimento duas vezes para o processamento de mais dois mililitros da mídia de cultura celular. Em seguida, para lavar os EVs isolados, injete um mililitro de PBS na câmara de amostra e gire o dispositivo na máquina giratória benchtop. Para rotulagem imunofluorescente dos EVs, injete um micrograma por mililitro do anticorpo específico do EV no orifício de eluição do dispositivo contendo 100 microliters de EVs isolados.
Em seguida, incubar por uma hora no escuro em um agitador de placas para garantir a distribuição uniforme do anticorpo através da amostra. Em seguida, conecte uma fita adesiva ao orifício de eluição. Injete um mililitro de PBS na câmara de amostra para lavar anticorpos residuais e gire o dispositivo até que a câmara de amostra esteja vazia.
Repita a lavagem injetando outro mililitro de PBS na câmara de amostra, e girando o dispositivo como demonstrado anteriormente. Depois de remover o fluido residual da câmara, pipeta os EVs fluorescentes rotulados da câmara de membrana em um tubo âmbar ou micro tubo. Proteja o tubo da luz até usar.
Semente quatro vezes 10 para a quarta células PC3 em um prato de 35 mililitros com uma mídia mililitro. Permita que as células aderam durante a noite em condições ideais de cultura celular. No dia seguinte, lave as células aderidas duas vezes com mídia exososome-esgotada.
Depois de diluir os EVs fluorescentes rotulados para a concentração apropriada usando mídia exosome-esgotada, adicione os EVs diluídos às células-alvo aderidas e incubar para o tempo experimental desejado. Depois de remover EVs não internalizados lavando as células três vezes com mídia livre de exosome, rotule o citoplasma das células aderidas com um micrograma por mililitro de CMTMR e incuba em condições ideais de cultura celular. Para imagens de células vivas, coloque as células preparadas na incubadora do palco.
Depois de definir os parâmetros de imagem baseados em amostras de controle, determine a profundidade das células-alvo e a faixa de tamanho de empilhamento na direção Z para adquirir imagens confocal 3D e, em seguida, defina a aquisição de imagem para múltiplas imagens empilhadas em Z de corante específico de células e corante específico do EV simultaneamente. Para processamento de imagens, utilize o software automático de processamento de imagens. Para construir superfícies virtuais das células, clique em Adicionar novas superfícies.
Para configurar as superfícies de células virtuais, clique no botão Adicionar e selecione Qualidade como o tipo de filtro. Limite o valor apropriado para o limite baixo por inspeção visual, defina o valor máximo para o limite superior e clique no botão Concluir em seguida, para construir os pontos virtuais dos EVs, clique no botão Adicionar novos pontos. Em Configurações de algoritmo, selecione Diferentes tamanhos de ponto e cálculo de distância mais curto, em seguida, clique em Próximo e selecione Canal 1 Alexa Fluor 488 como o canal de origem.
Digite o valor apropriado para o diâmetro XY estimado em Detecção de Ponto e clique em Next. Para configurar os pontos EV virtuais, clique no botão Adicionar e selecione Qualidade como o tipo de filtro. Defina o limiar inferior por uma inspeção visual e clique em "Seguintes para as regiões spot", selecione Intensidade Absoluta e clique em Seguir.
Para limiar da região de pontos EV, digite o valor adequado para Limiar da Região por inspeção visual. Selecione Diâmetro Em volume de região e clique em Concluir. Para dividir os pontos agrupados dentro da superfície construída, clique nas manchas de compilação e entre em Filtros.
Em seguida clique no botão Adicionar e selecione A distância mais curta para superfícies, superfícies surface 1 como o tipo de filtro. Depois de definir o limite mais baixo para o limite baixo e o valor apropriado para o limite superior, clique na Seção Duplicada para o novo botão Pontos. Para a contagem automática de EVs dentro das células, clique na seleção Built Spots 1, vá para Estatísticas e exporte o valor do Número Total de Pontos.
Para obter o número de células, clique nas Superfícies Construídas 1, em seguida, vá para Estatísticas e exporte o valor do número total de superfícies de geral. Por fim, vá para a guia Detalhado em Estatísticas para exportar o volume. Os EVs isolados da mídia de cultura celular PC3 usando um dispositivo microfluido baseado em nanofiltração foram rotulados com um anticorpo específico ev fluoro-4 conjugado, e visualizados usando microscopia confocal 3D.
Os EVs internalizados foram visualizados como puncta e um processamento individual EV.Post dessas imagens permite a visualização e quantificação da internalização do EV nas células. Os resultados do ensaio de absorção de EV indicam que o nível de absorção de EV depende da duração do período de incubação. O número de EVs internalizados pode ser normalizado para o volume da célula receptora para determinar a taxa real de absorção de EV para a célula especificada.
Este procedimento permite a exclusão sistemática de EVs não internalizados para medir precisamente o número de EVs internalizados. A distribuição de tamanho dos pontos EV internalizados é mostrada aqui. Assim, os principais passos são a utilização do dispositivo microfluido para rotulagem EV, a minimização da fluorescência de fundo ao visualizar EVs fluorescentes e, em seguida, a análise pós-imagem para determinar EVs internalizados versus superficiais.
Assim, o rastreamento intracelular de EV pode ser realizado em tempo real em um plano 3D e, além disso, a análise de tráfico de EV sobre resoluções espaciais/temporais e a co-localização de EVs com organelas subcelulares podem ser alcançadas. Por isso, acreditamos que essa técnica fornece uma maneira mais fácil e eficiente de investigar EVs dentro das matrizes intra e extracelulares para pesquisadores dentro do campo de comunicação celular para EVs.
