Este método apresenta uma maneira de criar andaimes derivados do tecido nativo que podem ser usados para a regeneração da cartilagem. A principal vantagem dessa técnica é que os componentes da cartilagem nativa são preservados nos andaimes que podem promover a formação da cartilagem e a regeneração in vitro e in vivo. Embora este método use cartilagem de articulações de sufocamento de equinos, a cartilagem de qualquer outra articulação também pode ser usada.
Para começar, obtenha uma articulação cadavérica intacta para isolamento da cartilagem e remova o excesso de gordura da pele e tecido muscular, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, defina o local onde a articulação se articula realizando inflexão de extensão da articulação. Faça uma incisão horizontal para alcançar a cavidade articular.
Em seguida, faça uma incisão vertical para abrir a área conjunta. A cavidade articular é preenchida com fluido sinovial que provavelmente escorrerá da cavidade ao realizar a incisão correta. Continue a abrir a articulação completamente removendo gordura, músculos e tendões excessivos, e cortando os tendões que mantêm a articulação unida.
Inspecione cuidadosamente a cartilagem para obter qualquer dano macroscópico. Se a cartilagem articular não tiver uma aparência mais brilhante ou se houver evidências, bolhas, fissuras ou defeitos, descarte a cartilagem e comece novamente. Use um bisturi estéril para remover a cartilagem do osso.
Corte todo o caminho até o osso subcondral para remover a cartilagem da zona profunda. Colete as fatias de cartilagem removidas em tubos de 50 mililitros contendo solução de lavagem de cartilagem previamente preparada. Durante o processamento, gotejar regularmente a solução de lavagem da cartilagem na cartilagem para evitar que a cartilagem seque.
Depois de coletar a cartilagem de todas as áreas de interesse, congele as fatias de cartilagem em nitrogênio líquido por cinco minutos. Em seguida, transfira as fatias de cartilagem em tubos de 50 mililitros e coloque imediatamente as fatias congeladas em uma secadora congelante. Lyophilize as fatias de cartilagem por 24 horas com o secador congelado.
Quando terminar, armazene as fatias de cartilagem secas congeladas em um local seco à temperatura ambiente. Para processamento manual, pré esfrie uma argamassa e pilão com nitrogênio líquido, em seguida, coloque as fatias de cartilagem liofilizada na argamassa e submerga-as e nitrogênio líquido. Triture diretamente as amostras manualmente por aproximadamente 45 minutos até que elas sejam suficientemente pulverizadas.
Alternativamente, para moer as amostras automaticamente usando uma máquina de fresar, comece por pré-resfriamento do compartimento de moagem da máquina de fresar adicionando nitrogênio líquido. Em seguida, adicione as fatias de cartilagem liofilizadas e mote a amostra em sua velocidade predefinida por alguns segundos até um minuto. Certifique-se de que todas as partículas são moídas e que nenhuma partícula fique na parte inferior do compartimento de moagem.
Por fim, acompanhe a técnica de descelularização descrita no protocolo de texto que acompanha antes da formação de andaimes. Transfira as partículas de cartilagem com um pequeno rótulo para um molde de plástico cilíndrico. Pressione todas as bolhas de ar para evitar cavidades no andaime e encha o molde completamente.
Para evitar cavidades nos andaimes, certifique-se de que as bolhas de ar sejam pressionadas enquanto enchem o molde com partículas de cartilagem. Após a formação, congele o molde por 10 minutos a menos 20 graus Celsius. Em seguida, liofilize os andaimes de cartilagem dentro do molde por 24 horas em uma secadora congelante.
Após a liofilização, remova cuidadosamente o andaime do molde. Coloque o andaime sob uma luz UV de comprimento de onda de 365 nanômetros e cruze-o durante a noite. Formar discos de andaimes cortando andaimes esterilizados em fatias de três milímetros de espessura.
Em seguida, transfira os andaimes para poços separados de uma placa de seis poços. Adicione um mililitro de Chondrocyte Expansion Medium em cima dos andaimes e deixe-os reidratar por 30 minutos. Enquanto os andaimes se reidratam, prepare as células e a pipeta 50 microliter da suspensão celular preparada em cima do andaime pré-encharcado.
Em seguida, incubar o andaime por uma hora a 37 graus Celsius. Ao usar condrócitos, certifique-se de que eles não foram expandidos após a primeira passagem, a fim de minimizar o número de células diferenciadas. Depois de uma hora, devolva a placa ao capô da cultura e vire cuidadosamente o andaime.
Pipetizar os 50 microliters restantes de suspensão celular no andaime e incubar por mais uma hora a 37 graus Celsius. Após a incubação, adicione três mililitros de médios aos poços com andaimes. Evite escoplar o meio diretamente nos andaimes e manuseie a placa de cultura suavemente para evitar o descolamento das células.
Devolva a placa à incubadora e célula de cultura cedeu andaimes a 37 graus Celsius. Uma combinação de coloração historlógica e quantificação de DNA têm sido utilizadas para mostrar que os métodos apresentados neste artigo resultam em descelularização suficiente do andaime de cartilagem. Os andaimes resultantes não continham células, juntamente com níveis indetectáveis de DNA.
Eles também não têm glicosaminoglicanos e são ricos em colágeno II.Aqui, a formação neo matricial é observada em andaime cedido com células-tronco mesenquimais que foram cultivadas por quatro semanas. A formação de gllicosaminoglicanos é abundante após quatro semanas. Após a tentativa desse procedimento, é importante examinar se a descelularização foi bem sucedida, antes de usá-la em qualquer aplicação.
Após esse procedimento, podem ser realizadas análises bioquímicas adicionais como o analisador de manchas ocidentais, a fim de responder a perguntas específicas sobre a presença de outros componentes, como fatores de crescimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de engenharia de tecidos explorarem estratégias de regeneração da cartilagem utilizando tecido descelularizado de fontes aogenéricas e sinagênicas. Precauções como usar jaleco e luvas devem ser sempre tomadas.
