Descrito neste vídeo é um protocolo para a criação e uso de andaimes de alginato macroporoso seco conhecidos como Drydux que promovem eficientemente a transdução de células T ativadas. O Drydux foi projetado para ser usado no lugar da espinoculação padrão-ouro de placas revestidas com RetroNectin, semeadas com vírus e simplifica o processo de transdução de células. O Drydux tem uma eficiência de transdução comparável à espinoculação em placas revestidas com RetroNectin, e serve como uma alternativa mais barata e conveniente ao método de transdução convencional.
Primeiro, prepare uma solução a 0,4% de cálcio-D-gluconato. Adicione água DI filtrada estéril ao gliconato de cálcio D em um copo. Mexa na velocidade média até que o gliconato de cálcio D tenha se dissolvido, o que leva aproximadamente 1 hora e meia.
Uma vez dissolvido, filtro estéril a solução de cálcio-D-gluconato. Esta solução pode ser armazenada à temperatura ambiente. Em seguida, prepare uma solução de 2% de alginato.
Isso pode ser feito usando um frasco para injetáveis de tampa de rosca ou um béquer. Ambos serão mostrados aqui. Adicione cuidadosamente o alginato ultrapuro ao vaso.
Adicione a quantidade apropriada de água DI ao alginato. Escolha a maior barra de agitação possível que não impeça a mistura e adicione-a ao recipiente. Mexa a solução no alto até que o alginato se dissolva, o que leva aproximadamente uma hora.
Se houver grandes aglomerados de alginato no lado do vaso, incline o vaso para os lados para desalojá-los. Pequenos aglomerados se dissolverão ao longo da hora e não são motivo de preocupação. Uma vez que a solução de 2% alginato se dissolve, reduza a velocidade de agitação.
Adicione lentamente um volume igual da solução de cálcio-D-gluconato à solução de alginato. Adicioná-lo lentamente ajudará a evitar a formação de aglomerados de reticulação. Quando a solução de gluconato de cálcio tiver sido adicionada, aumente a velocidade de agitação e mexa vigorosamente por 15 minutos.
Incline o vaso para os lados para remover quaisquer aglomerados que possam ter se formado. Depois de mexer vigorosamente por 15 minutos, certifique-se de que não há aglomerados na solução. Pipetar a solução para uma placa de 48 ou 24 poços.
Para uma placa de 48 poços, pipete 300 microlitros em cada poço. Certifique-se de lançar lentamente e mudar as pontas com frequência, pois a solução será viscosa e pode grudar na ponta. Para uma placa de 24 poços, pipete um mililitro em cada poço.
Novamente, lance lentamente e mude as pontas da pipeta com frequência. Cubra as placas do poço com uma tampa e congele a 20 graus Celsius negativos durante a noite. Prepare as placas para o liofilizador, removendo as tampas e prendendo o topo com lenços umedecidos e elásticos.
Coloque as placas no tubo liofilizador e coloque o liofilizador por 72 horas. Após 72 horas, retire a placa do liofilizador. Os andaimes estão agora prontos para serem usados para transdução.
Se não usar os andaimes imediatamente, sele a placa com parafilme e armazene a quatro graus Celsius até que seja necessário. Para armazenamento a longo prazo, recomenda-se selar a placa a vácuo, além de selar com Parafilme. Concentrar o sobrenadante viral centrifugando dois mililitros de solução viral através de um filtro centrífugo a 1, 500 g durante 10 minutos.
São necessários 100 a 200 microlitros de vírus concentrado por andaime. Gire por alguns minutos adicionais se o volume concentrado de solução de vírus for superior a 200 microlitros. Para cada andaime, faça uma alíquota de 1 milhão de células T ativadas suspensas em 50 microlitros de meios completos de cultura celular.
Adicione o vírus concentrado à suspensão celular. O volume total da suspensão do vírus celular não deve exceder 200 microlitros para um andaime de 48 poços, ou 350 microlitros para um andaime de 24 poços. Adicione a mistura de vírus celular gota a gota na parte superior do andaime seco.
Para experimentos de controle negativo, use meios de cultura celular completos no lugar do vírus concentrado. Adicione esta suspensão celular à parte superior do andaime seco. Incubar os andaimes na incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius por 45 a 60 minutos.
Remova os andaimes da incubadora. Os andaimes devem absorver totalmente a solução durante este tempo. Para induzir a proliferação, adicione meios de cultura celular completos suplementados com IL-7 e IL-15 a cada poço.
IL-2 também pode ser usado. Para um andaime de 24 poços, adicione um mililitro. Para um andaime de 48 poços, adicione 500 microlitros.
Incubar a 37 graus Celsius por 72 horas. As células proliferarão ao longo das 72 horas, o que pode tornar a mídia laranja. Remova o excesso de mídia de cada poço.
Para isolar as células do andaime, adicione uma solução de EDTA 0,25 molar a cada andaime. Adicione um mililitro para andaimes de 24 poços ou 300 microlitros para andaimes de 48 poços. Deixe o prato descansar ou agite suavemente por três a quatro minutos.
Uma vez dissolvido na maior parte, a pipeta entra e sai suavemente dentro do poço. Algumas etapas de pipetagem de entrada e saída podem ser necessárias para dissolver completamente o andaime. Transfira a solução para um tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Lave as células duas vezes com PBS. Adicione 12 mililitros de PBS a cada tubo de centrífuga. Centrifugar a 400 g durante cinco minutos.
Uma pelota de célula se formará na parte inferior do tubo. Aspirar a solução sobrenadante e repetir a lavagem. Tenha cuidado para remover completamente o sobrenadante a cada lavagem, pois é crucial se livrar de todo o EDTA.
Após a lavagem com PBS uma segunda vez, o pellet celular está pronto para análise. A citometria de fluxo foi utilizada para determinar a eficiência de transdução de cada grupo. Células não transduzidas foram utilizadas como controle negativo e não apresentaram transdução.
Células semeadas em andaimes sem retrovírus GFP também não apresentaram transdução. O grupo Drydux, que ativou células semeadas nos andaimes de alginato macroporoso seco, apresentou 85% de transdução, pouco menor que o grupo Retronectina. Estes resultados demonstram que os andaimes de Drydux efetivamente transduziram células por transferência de genes retrovirais sem a necessidade de espinoculação de placas revestidas de RetroNectin.
Os andaimes Drydux exibem alta eficiência de transdução comparável ao RetroNectin, fornecendo um método alternativo para a transdução de células T. Devido ao baixo custo de fabricação dos andaimes Drydux, esse processo tem o potencial de reduzir significativamente o custo das terapias com células T CAR.
