Nosso protocolo é significativo, pois permite a criação de doenças em hidrogéis que se assemelham muito à natureza do tecido cartilaginoso. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de produzir doença em hidrogéis com evidente atividade biológica em estrutura espacial, baixa imunogenicidade e função industrial biológica. Para começar, pique a cartilagem coletada usando um bisturi em pedaços de um a dois milímetros cúbicos de tamanho.
Em um tubo de centrífuga de 50 milímetros, submerja 20 gramas da cartilagem picada em 20 mililitros de tampão hipotônico de cloridrato de Tris. Coloque o tubo a 80 graus Celsius por três horas e, em seguida, no forno a 37 graus Celsius por três horas. Vórtice o tubo da centrífuga por 30 segundos a 1000 RPM.
Em seguida, filtre a cartilagem decelularizada usando uma peneira plástica colocada em um tubo centrífugo de 50 mililitros. Lave a cartilagem três vezes com PBS estéril antes de coletá-la. Adicione 10 mililitros de solução de tripsina à cartilagem coletada e incube-a em um agitador a 37 graus Celsius por 24 horas, substituindo a tripsina a cada quatro horas.
Após filtrar a suspensão, lavar a cartilagem tripsinizada com tampão hipertônico. Uma vez preservada a cartilagem, adicione 10 mililitros de solução de nuclease e coloque-a em um agitador a 37 graus Celsius por quatro horas. Após a lavagem com PBS estéril, adicione solução hipertônica de Tris-cloridrato à cartilagem e coloque-a no agitador, conforme demonstrado.
Uma vez lavado com PBS estéril, submergir o tecido em solução de Triton X-100 a 1% por 24 horas. Após a retirada do Triton X-100, enxaguar a cartilagem decelularizada com água destilada por três dias, trocando a água a cada 12 horas. Após três dias, adicionar solução de ácido peracético à cartilagem e deixá-la de molho por quatro horas.
Uma vez lavada com PBS, coletar a cartilagem usando uma peneira plástica como demonstrado anteriormente. Usando nitrogênio líquido, prepare pó de cartilagem decelularizada. Adicione 80 mililitros de ácido acético 0,5 molar e 20 miligramas de pepsina a dois gramas de pó de cartilagem e digerir a mistura por 24 horas a 37 graus Celsius.
Após a digestão, centrifugar a suspensão a 400 G por 10 minutos e coletar o sobrenadante, que agora é chamado de solução DC-ECM Para armazenar a solução DC-ECM, adicione um mililitro da solução a cada poço de uma placa de seis poços e coloque-a em um liofilizador. Uma vez que a solução é liofilizada, transfira-a para um tubo de centrífuga. Para formar um hidrogel, dissolva 20 miligramas de solução liofilizada DC-ECM em um mililitro de água destilada estéril.
Uma vez agitado, adicione um miligrama de vitamina B2 à solução de DC-ECM. Após a incubação, irradiar com luz UV por três minutos. Adicione o tampão GTL e proteinase K a 20 miligramas de pó de cartilagem DC-ECM e misture bem usando oscilação de vórtice.
Para a dissolução completa da cartilagem, incubar a mistura a 56 graus Celsius por quatro horas. Uma vez vórtice, adicionar 200 microlitros de tampão GTL seguido de etanol anidro. Após vórtice, centrifugar a amostra a 6000 G durante um minuto a quatro graus Celsius.
Em seguida, colete e quantifique o DNA conforme descrito no manuscrito. Para analisar o colágeno, acidifique cinco miligramas de pó DC-ECM em ácido clorídrico a 100 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, neutralize-o com cinco mililitros de solução de hidróxido de sódio seis molar.
Calcular o teor de hidroxiprolina da amostra neutralizada usando absorbância a 570 nanômetros em relação ao padrão de hidroxiprolina. Adicionar 500 microlitros de reagente A a 200 miligramas de pó de DC-ECM após a mistura. Incubar a amostra a quatro graus Celsius durante 16 horas.
Uma vez centrifugado, coletar 50 microlitros da solução da amostra e adicionar 50 microlitros do reagente B, seguido do reagente C.Após incubar a amostra por 10 minutos, adicionar 750 microlitros do reagente D e incubar por 30 minutos no escuro. Após a centrifugação, adicione um microlitro de reagente E ao pellet e misture bem antes de centrifugir. Em seguida, dissociar a amostra antes da medição do teor de GAG.
Na cartilagem DC-ECM preparada, o conteúdo de DNA foi significativamente eliminado. No entanto, o conteúdo de colágeno e GAG foi mantido em relação à cartilagem nativa. A análise por MEV e ETM demonstrou a ultraestrutura da DC-ECM preparada.
O hidrogel preparado no tubo invertido não fluiu para o fundo, demonstrando gelificação. Além disso, em comparação com a solução somente DC-ECM, a adição de vitamina B2 reduziu o tempo de gelificação devido à reticulação induzida durante a formação do hidrogel DC-ECM. A viscosidade do hidrogel DC-ECM foi maior que a viscosidade da solução e o aumento das taxas de cisalhamento diminuiu a viscosidade da solução.
Além disso, o alto módulo de armazenamento da solução DC-ECM e do hidrogel indicou que ambos tinham propriedades de gel e não de líquido. A análise por MEV demonstrou que o tamanho dos poros da solução de DC-ECM diminuiu significativamente na forma de hidrogel após reticulação e liofilização. O protocolo envolve uma combinação de ruptura física e química e digestão enzimática para remover o material celular, preservando a estrutura e a conversação da MEC.
