Esta técnica aproveita a microscopia de varredura a laser multi-fóton em conjunto com fotolise laser-flash de uma molécula de nicotina fotoativat. Permitindo ativação precisa de receptores colinérgicos nicotínicos. Esta técnica permite um controle espástico fino sobre a aplicação agonista do receptor nicotínico, fornecendo uma ferramenta poderosa para o estudo de padrões de expressão funcional receptor e transmissão sináptica ou de volume colinérgico.
Antes de iniciar o procedimento, use um puxador de pipeta programável para puxar uma micropipette de vidro com um diâmetro de abertura de 20 a 40 micrômetros. Coe aproximadamente um mililitro da solução de gravação através de um filtro de 0,22 mícron. E resuspenque nicotina fotoativat suficiente na solução de gravação filtrada para produzir uma concentração final de dois milimiliar.
Enchimento do micropipette de aplicação local puxado com 50 microliters da droga fotoativa, e fixar a pipeta em um suporte de pipeta montado em um micromanipulador. Conecte o suporte de pipeta através de um comprimento apropriado de tubulação a um sistema de ejeção de pressão capaz de aplicação sustentada de baixa pressão. E use o micromanipulador para manobrar a pipeta de aplicação local na solução de gravação extracelular.
Posicione a ponta da pipeta ligeiramente acima de uma amostra de tecido cerebral do rato, aproximadamente 50 micrômetros da célula de interesse. E aplique brevemente de um a dois quilos por polegada quadrada de pressão na pipeta. Deve haver mínimo a nenhum deslocamento da célula de interesse.
Depois de alcançar um grampo de remendo de células inteiras estáveis, ligue a aplicação baixa no dispositivo de ejeção de pressão e satura o tecido ao redor da célula com nicotina fotoativadora por um a dois minutos. A aplicação local introduz complexidade adicional ao experimento. Mas poupa compostos e permite que maiores concentrações de PA-Nic sejam utilizadas.
Para a aplicação do banho da nicotina fotoativa, primeiro dissolva o suficiente da droga liofilizada em um volume de solução de gravação apropriada para recirculação contínua a uma concentração final de 100 micromolar. E carregue a mistura resultante em um sistema de perfusão. Em seguida, inicie a recirculação da solução fotoativa de nicotina a uma taxa de 1,5 a 2 milímetros por minuto, usando tubos com um diâmetro interno mínimo e comprimento geral para minimizar o volume de recirculação necessário.
Durante a recirculação, bolha continuamente a solução com carbogen, e manter a temperatura do banho em 32 graus Celsius sob condições de baixa luz. A aplicação do banho beneficia-se da simplicidade e uniformidade da permeação pa-nic do tecido. Mas ele necessariamente utiliza concentrações de PA-Nic de micromolar mais baixas, e gasta maiores quantidades totais de compostos.
Para visualização ao vivo de um neurônio habenula medial, use luz transmitida ou câmera diferencial infravermelha e uma câmera de vídeo para estabelecer uma gravação estável de grampo de remendo de células inteiras. Depois de estabelecer a configuração de alta resistência anexada por células, mas antes da invasão, mude a configuração e o software para o modo de varredura a laser. Após a invasão, use escaneamento a laser para verificar se o corante de imagem de interesse está preenchendo passivamente o neurônio por difusão.
Deixe que o corante preencha os compartimentos celulares por pelo menos 20 a 30 minutos antes de usar a função de varredura ao vivo para visualizar o neurônio e o compartimento subcelular de interesse. Selecione parâmetros de imagem que permitam uma visualização ao vivo precisa dos recursos neuronais, manipulando as configurações apropriadas para afetar ou alterar a visualização do display, resolução, relação sinal-ruído e tempo de aquisição do quadro de imagem, conforme necessário. Para melhorar o contraste do sinal, abra a janela da tabela de procuração e ajuste as configurações do piso e do teto da mesa de parece.
Para localizar uma área de interesse dentro do tecido, selecione o zoom óptico de 1X e use os controles de panorâmica. Use a ferramenta série Z para selecionar uma posição de início e parada que contenha a célula de interesse. Defina um tamanho de passo de um micrômetro e selecione um tamanho de imagem que renderá uma imagem de maior resolução.
Muitas vezes 1.024 por 1.024 pixels por linha. Em seguida, imagem consecutiva do neurônio em cada plano Z que contém a célula. Para calibrar a estimulação do laser, inicie a varredura do sistema com uma potência laser de imagem maior que o mínimo, e ajuste o foco objetivo na fina camada de fluorescência do marcador vermelho.
Selecione uma área dentro do campo de fluorescência livre de detritos e revestida uniformemente com marcador, e abra o menu de ferramentas, calibração e alinhamento para selecionar a função de galvanização desacentada. Siga o tutorial de pontos de queimadura para a calibração espacial do segundo par de espelhos galvanômetros, selecionando o laser de 405 nanômetros, um poder de estimulação a laser de 400 e uma duração de estimulação de 20 milissegundos. Para produzir furos de um a cinco centímetros de diâmetro no marcador vermelho.
Selecione a atualização para estimular e atualizar a imagem após a queima do ponto central e mova o indicador vermelho redondo para a localização real dos pontos central, centro-direito e centro inferior para obter uma grade de nove pontos. Para testar a calibração, abra a janela de pontos de marca e ative manualmente os parâmetros de estimulação dos pontos definidos em uma nova área da amostra, tomando cuidado para que o arquivo de calibração mais recente correto seja carregado na janela de pontos de marca. Em seguida, aplique um pulso de teste para verificar a calibração correta.
Para visualizar brevemente e localizar a área subcelular de interesse, selecione digitalização ao vivo e use o zoom óptico para visualizar quaisquer pequenas estruturas conforme necessário. Coloque a mira de ponto de marca imediatamente adjacente à membrana celular, e defina os parâmetros de fotostimulação para uma duração de um a 50 milissegundos, uma potência laser de um a quatro miliwatts e pelo menos um teste. Em seguida, selecione pontos de marca de execução para iniciar o protocolo de pontos de marca e observe a aquisição de dados de eletrofisiologia em tempo real.
Fluorescência de nicotina 2PE fotoativante de pa-nic de um mililitro é facilmente detectada durante a ejeção de pressão de uma pipeta de aplicação local como demonstrado. Considerando que a entrega dos principais produtos fotoquímicos da fotolise fotoativatável da reação de fotolise de nicotina não gera nenhum sinal fluorescente na mesma concentração e poder de excitação e comprimento de onda. Demonstrando a especificidade dos resultados fotoativados da nicotina.
A imagem da nicotina fotoativat aplicada ao tecido cerebral como demonstrado revela a presença da droga dentro de 100 a 200 micrômetros da pipeta de aplicação local. Confirmando que a nicotina fotoativa pode ser efetivamente entregue ao tecido cerebral através da aplicação local. Aqui, imagens de alta qualidade dentro das quais a morfologia neuronal parece estar completa, o ruído é minimizado, e os detritos não interferem na interpretação da morfologia celular, são mostrados.
Essas imagens, no entanto, são de menor qualidade. Devido a uma menor relação sinal-fundo e detritos substanciais. Emparelhar microscopia de escaneamento a laser de dois fótons de neurônios de habenula medial em fatias cerebrais com fotolise flash laser de PA-Nic como demonstrado, permite a reconciliação das respostas eletrofisiológicas com morfologia celular.
A fotolise de ponto único realizada em intervalos de 10 segundos permite um tempo de recuperação suficiente para a corrente de retenção da linha de base. Enquanto um intervalo mais curto de um segundo leva a um aumento gradual da corrente de espera à medida que o protocolo prossegue. Sugerindo que a nicotina não tem tempo suficiente para difundir para longe do sistema com os intervalos mais curtos.
Ao projetar experimentos que utilizem moléculas fotoativas, é importante lembrar de selecionar indicadores fluorescentes e relatar fluoroforos com espectros de emissão de excitação compatíveis. Pa-Nic é compatível com fluoroforos mais comuns devido ao seu curto pico de fotolise de comprimento de onda. Ao escolher a técnica de aplicação pa-nic mais adequada, é importante considerar cuidadosamente a expressão funcional, atividade fisiológica dos receptores nicotínicos nos neurônios de interesse.
A utilização qualificada desta técnica permite um bom controle espostetemporal da aplicação da nicotina, o que permite novas possibilidades interessantes para estudar a cinética do engajamento do receptor nicotínico nativo, localização subcelular e modulação da atividade neuronal pela ativação do receptor nicotínico.
