Este protocolo é significativo para determinar a função glicolítico e a respiração mitocondrial em candida albicans. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que a função mitocondrial seja medida sem a necessidade de purificar mitocôndrias de candida albicans. Este método pode ser otimizado para investigar os efeitos da manipulação genética ou moduladores químicos em vias mitocondriais e glicolíticas em abicanos candida ou outros patógenos fúngicos.
Esta técnica é relativamente simples. Ou dependendo do organismo, seu uso pode ajudar a otimizar o número celular e a concentração de inibidores mitocondriais em seu ensaio. Em uma capa de fluxo laminar, dissolva a Poly-D-Lysine na água da rede de tecidos para uma concentração final de 50 microgramas por mililitro.
Misture bem a solução e aliquot-la em tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro, certificando-se de alíquotar de pelo menos 1,3 mililitros por tubo. Adicione 50 microliters desta mistura a cada poço da placa de ensaio, cubra a tampa e incubar à temperatura ambiente por uma a duas horas. Então aspire a solução.
Enxágüe os poços da placa de ensaio uma vez com 500 microliters de água de grau de cultura tecidual estéril, abra a tampa e deixe os poços secarem. Se não estiver usando a placa no dia em que estiver preparada, armazene-a a quatro graus Celsius por um máximo de dois a três dias. Um dia antes do experimento, abra o kit de ensaio de fluxo extra e remova o conteúdo.
Coloque o cartucho do sensor de cabeça para baixo ao lado da placa de utilidade. Encha cada poço da placa de utilidade com um mililitro de calibrante e, em seguida, coloque o cartucho do sensor de volta. Certifique-se de que os sensores que contêm fluoroforos estão submersos no calibrante.
Incubar o cartucho do sensor a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono durante a noite. Um dia antes do ensaio, inocular os albicanos C preparados no caldo YPD e crescer durante a noite a 30 graus Celsius em um shaker a 200 rpm. No dia do ensaio, diluir um número adequado de células no meio de ensaio para produzir uma concentração final de 100.000 células por 100 microliters.
Adicione 100 microliters das células diluídas em cada poço da placa de ensaio, exceto os poços A1, B4, C3 e D6. A esses poços, adicione apenas 100 microliters de meio de ensaio para correção de fundo. Incubar a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono por 60 minutos para deixar as células aderirem à superfície da placa. Prepare os compostos para o ensaio da função mitocondrial na concentração de 10X no meio de ensaio correspondente, conforme descrito no protocolo de texto.
Adicione 50 microliters de SHAM na porta A, 50 microliters de Oligomicina na porta B, 62 microliters de cianeto de potássio na porta C, e 68 microliters de Antimicina A na porta D.Next, prepare os compostos para o ensaio de estresse glicolítico na concentração de 10X no meio de ensaio correspondente, conforme descrito no protocolo de texto. Adicione 50 microliters de glicose à porta A, 55 microliters de Oligomicina na porta B, 62 microliters de 2-DG na porta C e 68 microliters de Antimicina A na porta D.Antes do ensaio, abra o analisador de fluxo extra e configure o modelo de ensaio usando o assistente de guia de ensaio. Siga as instruções passo a passo e preencha todas as informações que aparecem durante a configuração.
Gere um layout de grupo e configure o protocolo conforme descrito no protocolo de texto. Salve esses layouts antes do ensaio. No momento do ensaio, restaure o protocolo salvo abrindo o arquivo correspondente na opção arquivo aberto na guia assistente de ensaio.
Em seguida, carregue os compostos de 10X nas respectivas portas do cartucho hidratado contendo o calibrante. Carregue o cartucho do sensor na bandeja portadora do analisador de fluxo extra. Inicie a calibração clicando no botão iniciar na tela.
Em seguida, adicione suavemente 350 microliters do meio de ensaio à placa celular ao longo da lateral das paredes para minimizar a perturbação celular, trazendo o volume final para 450 microliters. Substitua a placa de utilidade contendo o calibrante com a placa de ensaio e continue o ensaio. Uma vez que o ensaio esteja concluído, remova o cartucho do sensor e a placa.
Salve o arquivo na pasta de destino apropriada. Neste estudo, as funções bioenérgicas dos albicanos C são avaliadas por analisador de fluxo extra. Um mutante sem a proteína mitocondrial mam33 também está incluído junto com sua cepa complementar para estudar os efeitos da exclusão de uma proteína mitocondrial na taxa de consumo de oxigênio e taxas de acidificação extracelular.
O tipo selvagem de C albicans mostra uma taxa de consumo de oxigênio de 145 picomoles por minuto que está bem dentro da faixa ideal para qualquer ensaio de fluxo extracelular. A taxa de consumo de oxigênio basal do tipo selvagem, as cepas mam33 mutantes e mam33 complementadas não mostram diferenças. Da mesma forma, não são observadas diferenças significativas nas taxas de acidificação extracelular basal entre as cepas.
No entanto, ao inibir o complexo-IV com cianeto de potássio, do tipo selvagem e do mutante mam33, as cepas complementadas mam33 mostram uma mudança significativa em direção à glicólise. A cepa mutante mam33, no entanto, não mostrou uma mudança glicolítico compensatória sugerindo que a via dependente composta-IV está prejudicada nesta cepa. No teste de estresse glicolítico, as células estão famintas de glicose por uma hora e a taxa de consumo de oxigênio basal e a taxa de acidificação extracelular são medidas.
Após a fome, a cepa mutante mam33 mostra um consumo significativamente menor de oxigênio e taxas de acidificação extracelular em comparação com as outras cepas. Isso sugere uma utilização prejudicada da glicose para respiração e glicolise quando as células são forçadas à condição de fome. Após a injeção de glicose, todas as cepas mostram estimulação tanto de sua taxa de consumo de oxigênio quanto da taxa de acidificação extracelular.
O revestimento da placa de ensaio permite que as células de candida albicans aderam à placa. A adesão inadequada das células de candida albicans afetará o resultado do ensaio. Após o desenvolvimento dessa técnica, ela tem sido empregada em uma ampla gama de tipos e doenças celulares que abordam como as mitocôndrias funcionam durante as condições fisiológicas e patológicas.
Por exemplo, empregando células de controle e derivadas do paciente neste ensaio, é possível abordar as questões específicas de como a função mitocondrial é alterada. Deve-se tomar cuidado durante a preparação de inibidores mitocondriais, como cianeto de potássio e antimicina A, porque esses compostos são extremamente venenosos.
