O projeto descrito foi apoiada pelo Prêmio Número R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) do Instituto Nacional de Saúde Mental. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva de seus autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do Instituto Nacional de Saúde Mental ou o National Institute of Health.

O protocolo a seguir descreve o procedimento padrão para isolar RNA de LCR e de perfil microRNAs usando placas de PCR prontos. Note-se que a extracção de fase orgânica é opcional, e que um ARN transportador é adicionado à amostra durante a extracção para assegurar a recuperação máxima de ARN. Consequentemente, não há necessidade de quantificar o ARN. Em geral, a média de 6-8 placas pode ser executado no mesmo dia que o cDNA é sintetizado no dia anterior (cerca de 2 horas). A análise dos dados é executada quando todas as amostras tiverem sido perfilado e carregada no software. Dependendo do número de amostras / grupos ou a sua combinação para efeitos de comparação, a análise dos dados pode necessitar de uma a várias horas. 1. Extração de RNA A extracção de ARN foi realizada a partir de amostras de CSF, armazenadas congeladas a -80 ° C em alíquotas até análise. Para este procedimento foi utilizado o kit de isolamento de miRvana Paris, após o instrumento de fabricanteCÇÕES para o isolamento de RNA total. Por favor, note que, embora o enriquecimento de espécies de RNA pequenos é possível com este kit, este passo não for feito eo processo de extração de RNA é encerrado após a etapa de isolamento total de RNA. Além disso, embora o kit de isolamento de miRvana Paris (como outros kits de isolamento de RNA comercialmente disponíveis) não necessita de extracção orgânico, um protocolo para este procedimento pode ser encontrada abaixo. O protocolo de extracção de ARN consiste em duas etapas: 1.1. Extração Orgânica (não é necessário se estiver usando o kit de extração de RNA Mirvana Paris) 1.2.2. Isolamento de ARN total 1.1. Extracção orgânica 1.1.1. Preparar reagentes <ol><li> Adicionar 375 mL de 2-mercaptoetanol 2x solução de desnaturação e armazená-lo a 4 ° C. </li></ol> 1.1.2. Prepare o CSF <ol><li> Descongele cada alíquota de CSF no gelo antes da extração de RNA. Adicione 1 mg de RNA transportador MS2 para 0,5 ml de CSF descongelado e gentilmentemisturar. Note-se que, se a extracção orgânica é omitido, o transportador de MS2 será adicionado à amostra de isolamento de ARN antes descrito em 1.2.2.1 abaixo. </li><li> Misturar 0,5 ml de 2x solução de desnaturação à temperatura ambiente para o CSF. </li><li> Adicionar 1 ml de ácido-fenol: clorofórmio para o CSF ​​mais a solução desnaturante 2x: certifique-se de retirada da fase inferior contendo o ácido-fenol: clorofórmio, o tampão não aquoso que se encontra no topo da mistura. Além disso, observe que o ácido-fenol: clorofórmio contém fenol, que é um veneno e um irritante, utilizar luvas e outros equipamentos de proteção individual ao trabalhar com este reagente. </li><li> Vortex por 30-60 segundos para misturar. Por conveniência, os 2 ml de amostra / desnaturante solução / ácido-fenol: mistura de clorofórmio são divididos em dois tubos Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos à velocidade máxima (10000 xg), à temperatura ambiente. </li><li> Cuidadosamente remover a fase aquosa (superior), sem perturbar a fase inferior ou a interfase e transferi-lo para umatubo fresco. Observe o volume recuperado. </li></ol> 1.2. Isolamento de ARN Recomenda-se a ter um banco dedicado, um conjunto de pipetas e racks para lidar com amostras de RNA. A área de trabalho e as ferramentas são descontaminados utilizando spray de RNase Zap e limpa antes de cada experimento. 1.2.1. Preparar reagentes: <ol><li> Adicionar 21 ml de etanol a 100% a miARN solução de lavagem 1 e 40 ml de etanol a 100% para a solução de lavagem de 2/3. Por favor note que miRNA Wash Solution 1 contém tiocianato de guanidina, que é uma substância potencialmente perigosa. </li></ol> 1.2.2. Isolamento de ARN total <ol><li> Adicionar 1,25 volumes de etanol a temperatura ambiente de 100% para a fase aquosa da extracção orgânica e misturar completamente. </li><li> Coloque um cartucho de filtro em um dos tubos de coleta. </li><li> Pipeta não mais do que 700 ul da mistura de ligado / etanol para o cartucho de filtro. </li><li> Centrifugar por 30 segundos no máximovelocidade. Aplicar a mistura superior a 700 ul em aplicações sucessivas com o mesmo filtro. Descarte o flow-through após cada centrifugação e salvar o tubo de coleta para as etapas de lavagem. </li><li> Aplicar 700 mL miRNA solução de lavagem 1 para o cartucho do filtro e centrifugar por 15 segundos na velocidade máxima. Descarte o fluxo através do tubo de coleta e substituir o cartucho do filtro no mesmo tubo de coleta. </li><li> Aplicar 500 mL de solução de lavagem de 2/3 e centrifugar por 15 segundos na velocidade máxima. Descarte o fluxo através do tubo de coleta e substituir o cartucho do filtro no mesmo tubo de coleta. Aplicar uma segunda 500 mL de solução de lavagem de 2/3 e centrifugar por 15 segundos na velocidade máxima. Descarte o fluxo através do tubo de coleta e substituir o cartucho do filtro no mesmo tubo de coleta. Girar o conjunto durante 1 minuto à velocidade máxima, para remover o líquido residual a partir do filtro. </li><li> Transfira o cartucho do filtro em um tubo de coleta de fresco. Aplicar 100 &amp; mu; L de pré-aquecido (95 ° C), água livre de nuclease para o centro do filtro, e fechar a tampa. Centrifugar durante 30 segundos a velocidade máxima, para recuperar o RNA. </li><li> Recolher o eluato contendo RNA e armazená-lo a -80 ° C para aplicações subseqüentes. </li><li> Quantificar 1 ml de RNA utilizando o espectrofotômetro NanoDrop 2000c. Note-se que a quantificação de RNA pode ser ignorado se um transportador de RNA é adicionado à amostra durante a extracção de RNA. Nesse caso, 8 ul de RNA são submetidos a síntese de cDNA, como detalhado abaixo. </li></ol> 2. miARN Perfil: Protocolo de qRT-PCR O protocolo para a miARN perfis consiste em duas etapas: <ol><li> A síntese de cDNA da primeira cadeia </li><li> Real-time PCR </li></ol> 2.1. A síntese de cDNA da primeira cadeia 2.1.1. Dilui-se ARN modelo <ol><li> Ajustar cada uma das amostras de ARN do molde para uma concentração de 5 ng / mL usando nuclease isenta de água. Se oARN não foi quantificada (ver passo 1.2.2.9) e, em seguida 8 ul de RNA são utilizados para a síntese de cDNA </li></ol> 2.1.2. Preparar reagentes <ol><li> Gentilmente descongelar o tampão de reação 5x e água livre de nuclease e coloque imediatamente em gelo. </li><li> Misture em vortex. Ressuspender o RNA spike-in através da adição de 40 mL de água livre de nuclease para o tubo e misturar em vortex; deixá-lo no gelo por 15-20 min. Imediatamente antes da utilização, retire a mistura de enzimas do congelador, misture sacudindo os tubos e coloque no gelo. Gire para baixo todos os reagentes. </li></ol> 2.1.3. Configuração de reação de transcrição reversa <ol><li> Preparar a quantidade necessária de solução de trabalho de RT em um tubo Eppendorf de 1,5 ml ou equivalente (nas proporções indicadas na Tabela 1, com excepção para o molde de ARN), misturar em vortex (1-2 segundos a velocidade máxima), girar rapidamente para baixo ( usamos um mini centrífuga Eppendorf com velocidade fixa, 10 seg) e colocá-lo no gelo. Note-se que o RNA de pico UniSp6-In é adicionado à amostra antes da reacção de RT (ver Tabela 1). </li><li> Dispensar a solução de trabalho RT em tubos de PCR livre de nuclease. </li><li> Dispensar molde de ARN em cada tubo. Nota: lembre-se de calcular 10% de excesso de volume / cada reagente para pipetagem e / ou volume morto robótico. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Painel I Volume (mL) </td><td> Painel I + II Volume (mL) </td></tr><tr><td> De tampão de reacção 5x </td><td> 4.4 </td><td> 8.8 </td></tr><tr><td> Nuclease livre água </td><td> 9,9 </td><td> 19,8 </td></tr><tr><td> Mistura de enzima </td><td> 2.2 </td><td> 4.4 </td></tr><tr><td> UniSp6 RNA Spike-no template </td><td> 1.1 </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> RNA total de molde (5 ng / mL) </td><td> 4.4 </td><td> 8.8 </td></tr&gt; <tr><td> Volume Total </td><td> 22 </td><td> 44 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Reverter configuração reação de transcrição. </li></ol> 2.1.4. Misture e girar reagentes <ol><li> Misture a reacção por agitação suave (1-2 seg) vórtex para assegurar que todos os reagentes são bem misturados. Após a mistura, spin down (mini centrífuga Eppendorf com velocidade fixa, 10 seg). </li></ol> 2.1.5. Incubar e inativar calor <ol><li> Programar uma máquina de PCR como se segue: </li><li> Incubar durante 60 minutos a 42 ° C </li><li> Heat-inactivar a transcriptase reversa durante 5 min a 95 ° C </li><li> Imediatamente arrefecer a 4 ° C </li><li> Armazenar a 4 ° C ou congelar Nota: o protocolo pode ser interrompido a esta fase. O cDNA não diluída pode ser mantida a -20 ° C durante até 5 semanas (opcional armazenar a 4 ° C durante até 4 dias). </li></ol><pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; 2.2. Real-time PCR 2.2.1. Preparar reagentes para PCR em tempo real <ol><li> Coloque cDNA (a partir do passo 2.1.5) em gelo. </li><li> Água livre e PCR Master Mix nuclease Thaw no gelo. Proteger os frascos de PCR master mix de luz, cobrindo-os com papel alumínio. Imediatamente antes da utilização, misture o Mix Master PCR em vortex 1-2 sec em um mini centrífuga e girar a 1.500 xg por 1 min. </li></ol> 2.2.2. Combine SYBR Green master mix, água e cDNA e adicionar placas de PCR O procedimento seguinte é recomendado para evitar a baixas concentrações de cDNA a partir de aderir à superfície do tubo: <ol><li> Antes de retirar o selo da placa, rodar rapidamente para baixo da placa (s) em uma centrífuga refrigerada a 1.500 xg durante 1 min. </li><li> Em um tubo de 15 ml, combinam 2x Mix Master PCR e água. Painel I: 2.000 mL 2x mix master e 1.980 mL de água; Painel I + II: 4.000 mL 2x master mix e 3960 μ, L de água. </li><li> Adicionar 20 mL de cDNA (Painel I) ou 40 mL de cDNA (painel I + II) e misturar. </li><li> Misture suavemente em vortex 1-2 seg e spin para baixo em uma centrífuga refrigerada a 1500 xg por 1 min. </li><li> Coloque o PCR Master Mix / cDNA mistura em uma pipeta multicanal reservatório. Pode ter de identificar um reservatório que possui o comprimento da pipeta multicanal. Isso mantém o nível de volume de alta o suficiente para permitir que alíquotas de volume iguais em toda a multicanal. Isso é fundamental para os últimos alíquotas. </li><li> Dispensar 10 ul de mistura de PCR Master / cDNA misturar a cada poço da placa de 384 poços com uma pipeta de 16 canais. </li><li> Selar a placa com vedação óptica. </li><li> Rotação placa brevemente numa centrifugadora refrigerada (1500 xg durante 1 min), para misturar as soluções e remover as bolhas de ar. Nota: o experimento pode ser interrompido neste ponto. Armazenar as reacções protegidas da luz a 4 ° C durante até 24 horas. </li></ol> 2.2.3. Real-Time PCR Realizar em tempo real a amplificação por PCR e análise de curva de fusão após os parâmetros descritos na Tabela 2. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Etapa do Processo </td><td> Configurações, Roche LC480 </td></tr><tr><td> Polymerase Ativação / desnaturação </td><td> 95 ° C, 10 min </td></tr><tr><td> Amplificação </td><td> 45 ciclos a amplificação 95 ° C, 10 seg 60 ° C, 1 min Taxa de rampa 1,6 ° C / seg Leitura óptica </td></tr><tr><td> Análise da curva de fusão </td><td> Sim </td></tr></tbody></table> Tabela 2. PCR em tempo real as condições de ciclo utilizando o LightCycler 480. 2.3. Análise em tempo real de dados de PCR A análise em tempo real de dados de PCR é realizada com o Exiqon GenEx Professional 5.0, a seguir tele recomendou instruções. O manual GenEx passo-a-passo pode ser baixado em <a href="http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf">http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf</a> A análise de dados é constituído por três passos: <ol><li> Importação de dados </li><li> Pré-processamento de dados </li><li> A análise estatística </li></ol> 2.3.1. Importação de dados <ol><li> Na Roche LightCycler 480 selecionar o método de análise de 2 ª derivada e calcular os valores de Cq. Os dados são exportados como uma mesa e salvos como arquivos de texto. </li><li> Para importar os dados, aberto GenEx e clique no botão assistente de importação Exiqon e clique em &quot;Start&quot;. Siga as instruções para selecionar o formato, instrumento e arquivo layout da placa (s). Note que os arquivos de layout de placas (Excel arquivos) são baixados do site da Exiqon ( <a href="http://www.exiqon.com/plate-layout-files">http://www.exiqon.com/plate-layout-files</a> ). </li><li> Import painéis I e II e clique em &quot;Next&quot;. </li><li> A tabela gerada após a importação do arquivo contém colunas predefinidas. Amostras nomes podem ser editados e colunas de classificação podem ser adicionados ou removidos nesta etapa. Clique em &quot;Next&quot; quando você está feito. </li><li> Salve os dados e carregar para o Editor de Dados. </li></ol> 2.3.2. Pré-processamento de dados <ol><li> Conforme recomendado pelo Exiqon e GenEx, ao comparar múltiplas placas, a primeira coisa a fazer é calibrar os dados entre as placas, escolhendo calibração inter-prato do menu de pré-processamento. </li><li> Recomenda-se a executar as matrizes de miRNA em triplicado corridas. Se um miRNA não está presente em pelo menos duas das três réplicas ele será definido como nonexpressed. </li><li> Na próxima etapa do pré-processamento, definir um ponto de corte. A definição de um valor de corte indica que os dados com um ciclo limiar (C T) mais elevado do que este valor, são descartados. Nos presentes experimentos usando amostras de líquido cefalorraquidiano, o off corte foi fixado em 39. Therntes, todas as amostras com um C t superior a 39 nas três réplicas serão descartadas. Se um miRNA tem um C t&gt; 39 para uma sonda (uma réplica de três), que a leitura será substituído com a média da C t para as outras duas sondas, desde que sejam ambos abaixo 39. </li><li> Definir genes de referência. GenEx profissional tem a opção de utilizar geNorm e / ou NormFinder para identificar genes de referência. Selecione uma lista de miRNAs que têm valores semelhantes em todos Cq amostra e executar geNorm e / ou NormFinder. De acordo com esta análise, no exemplo apresentado aqui, o miR-622 e miR-1266 teve os valores mais uniformes entre as amostras e foram escolhidos como os genes de referência (Figura 1). </li><li> Em seguida, os dados são normalizados utilizando os genes de referência e os valores obtidos correspondem ao Ac t </li><li> No caso das reacções de síntese de cDNA foi realizada em triplicado, neste ponto os valores devem ser calculadas. </li><li> Validar a folha de remover colunas vazias e quase vazias. Na janela de pré-processamento, selecione &quot;Validar folha&quot;, e que se aplicam na linha de colunas vazias Remove. Na linha abaixo, escolha a porcentagem desejada de dados válidos e clique em Aplicar. Por exemplo, selecione 100%, se você quiser comparar apenas miRNAs comuns a todas as amostras. </li><li> Manipular dados em falta. Selecione &quot;Dados em falta&quot; no menu de pré-processamento e escolheu uma das opções para lidar com dados faltantes. Esta etapa é necessária. Note-se que GenEx lhe dará erro se você tentar carregar arquivos que contêm dados em falta não tratadas. </li><li> Determine quantificação relativa entre grupos de amostras (ie. Experimentais versus controle). A quantificação relativa entre os grupos é calculada usando o método ΔΔ C t. Em GenEx, clique na guia de pré-processamento e selecione quantificação relativa. Na janela, selecione o grupo de referência e clique em Aplicar. Observe que, para as representações gráficas e / ou para as análises estatísticas, expressão dados devem ser convertidos para uma escala logarítmica. No menu de pré-processamento, selecione Log2. </li></ol> 2.3.3. Análise Estatística Software GenEx permite uma ampla gama de análises estatísticas, incluindo T-teste e análise de variância. <ol><li> Carregue o arquivo mdf final para GenEx e gerenciador de dados aberto. É crítico para seleccionar as amostras de correcção ou de grupos de amostras para as quais a análise estatística é realizada. </li><li> Selecione &quot;Estatísticas&quot; e escolheu o ícone correspondente ao teste desejado. </li><li> Clique em &quot;Run&quot; na janela do painel de controle. Exceto resultados como excel ou mdf. </li></ol> 2.3.4. Expressão profiling MicroRNAs e amostras podem ser classificadas, agrupadas e visualizados em calor-mapas e dendrogramas, como se segue <ol><li> Carregue o arquivo mdf final para GenEx e gerenciador de dados aberto. Utilize esta janela para selecionar e criar grupos de amostras ou miRNAs. Clique em &quot;Aplicar&quot; quando você está feito. </li> &lt;li&gt; No canto esquerdo superior de seleção de cluster e clique no ícone heatmap </li><li> Na janela do painel de controle clique em &quot;Executar&quot;. O heatmap podem ser salvos em vários formatos, como TIFF ou BMP, mas também pode ser copiado e modificado conforme a necessidade. </li></ol>

<ol>
	<li>Pacifici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+miRNA+profile+in+HIV-encephalitis.">Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis.</a> J. Cell. Physiol. 10, (2012).</li><li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis,+function+and+decay.">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+in+human+cancers.">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microRNAs+in+serum:+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases.">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li><li>De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+as+biomarkers+for+CNS+cancer+and+other+disorders.">MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders.</a> Brain Res. 1338, 100-111 (2010).</li><li>Heneghan, H. M., Miller, N., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNAs+as+biomarkers+and+therapeutic+targets+in+cancer.">MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 543-550 (2010).</li><li>Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNA+in+body+fluid:+a+new+potential+biomarker+for+cancer+diagnosis+and+prognosis.">Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis.</a> Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers.">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li><li>Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA:+small+molecules+as+potential+novel+biomarkers+in+cancer.">miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer.</a> Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).</li><li>Blondal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+sample+and+miRNA+profile+quality+in+serum+and+plasma+or+other+biofluids.">Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids.</a> Methods. 59, 1-6 (2013).</li><li>Jensen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+commercial+global+miRNA+expression+profiling+platforms+for+detection+of+less+abundant+miRNAs.">Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs.</a> BMC Genomics. 12, 435 (2011).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

MicroRNAs são pequenos RNAs não codificadores que regulam a expressão de genes, inibindo a tradução e / ou a promoção da degradação do mRNA 2. Devido à sua elevada estabilidade em condições livres de células, microRNAs foram detectados em muitos fluidos corporais. Além disso, o perfil de expressão de microRNAs distinta tem sido correlacionada com o estágio e / ou progressão em uma variedade de cânceres humanos 3-9. Existem várias ferramentas disponív...

MicroRNAs pertencem à família de pequenos (21-23 nt de comprimento) não codificante ARN que regulam a expressão do gene de pós-transcricionalmente. microRNAs pode ser secretada no espaço extracelular, onde eles parecem ser relativamente estável. Ao determinar mudanças na expressão de miRNA pode ser um passo importante para identificação de biomarcadores, realizando perfis de miRNA e lidar com uma grande quantidade de dados pode ser intimidante. Aqui, nós descrevemos um protocolo para determinar mudanças na expressão de miRNA no líquido cefalorraquidiano (aplicável a outros fluidos corporais) por um tempo real sensível PCR. Nós também descrevem o uso de software para análise de dados, incluindo a análise estatística e representação gráfica dos resultados. Todo o procedimento é relativamente simples e fácil e, dependendo do número de amostras a serem perfiladas e o número de máquinas de PCR em tempo real disponíveis, também relativamente rápidos. A parte experimental requer precisão na manipulaçãoRNA e pipetagem em placas de 384 poços, enquanto a seção de análise de dados usando GenEx requer alguns conhecimentos básicos em informática e estatística.

Table III. List of equipment
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:27px;">
			Equipment
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:27px;">
			Company
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:27px;">
			Catalog Number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Finnpipette Novus Multichannel Pipetter
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			HH05279
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Finntip Pipette Tips
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			9400613
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Thermal Cycler C1000
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			TLS0801
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Flat Cap Strips
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Biorad
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			TLS0803
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			LightCycler&#174; 480 Real-Time PCR System
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Roche
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			LightCycler&#174; 480 Sealing Foil
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Roche
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			04 729 757 001
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Refrigerated Centrifuge 5804R
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Swing-bucket Rotor, 4-place
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			A-4-44
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Mini Centrifuge
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			05-090-100
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Vortex
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			02-681-5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Matrix Reagent Reservoir, 25 ml
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Thermo Scientific
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			8093
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Thermomixer Confort
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:301px;height:21px;">
			Bench-Top Vortex
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:150px;height:21px;">
			Velp Scientifica
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:204px;height:21px;">
			F202A0173
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Table IV. List of reagents
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:25px;">
			Reagents
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:25px;">
			Company
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:25px;">
			Catalog Number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203300
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203400
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Invitrogen
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			10977-015
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Exiqon
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			203608
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			mirVana&#8482; miRNA isolation Kit, 40 isolations
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Ambion
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			AM1556
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			MS2 RNA carrier
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Roche Applied Science
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			10165948001
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			2Betamercaptoethanol 98%
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Sigma Aldrich
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			M3148-25ml
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Ethanol 100%
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Carlo Erba
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			64-17-5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			Nuclease free water
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Qiagen
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			1039480
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:343px;height:21px;">
			RNAse Zap&#174;
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:168px;height:21px;">
			Ambion
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:144px;height:21px;">
			AM9780
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cerebrospinal fluid microrna profiling using quantitative real time pcr

<html> MicroRNAs (miRNAs) constituem uma camada poderosa de regulação gênica, orientando RISC para atingir sítios localizados em mRNAs e, conseqüentemente, modulando sua repressão translacional. Alterações na expressão de miARN têm mostrado estar envolvidas no desenvolvimento de todas as principais doenças complexas. Além disso, resultados recentes demonstraram que os miRNAs pode ser secretada para o meio extracelular e entram na corrente sanguínea e outros fluidos corporais onde pode circular com elevada estabilidade. A função de tais miRNAs circulantes permanece difícil, mas as abordagens de alto rendimento sistemáticos, tais como matrizes de perfil miRNA, levaram à identificação de assinaturas miRNA em várias condições patológicas, incluindo doenças neurodegenerativas, e vários tipos de cancros. Neste contexto, a identificação do perfil de expressão de miRNA no líquido cefalorraquidiano, como relatado em nosso estudo recente, faz miRNAs candidatos atraentes para análise de biomarcadores. _content &quot;&gt; Existem várias ferramentas disponíveis para perfilar microRNAs, tais como microarrays, quantitativa PCR em tempo real (qPCR) e seqüenciamento de profundidade. Aqui, descrevemos um método sensível para o perfil de microRNAs em fluidos cerebrospinal por quantitativa PCR em tempo real. Nós utilizados os painéis humanos PCR prontos para uso Exiqon microRNA I e II V2.R, que permite a detecção de 742 microRNAs humanos únicos. Realizamos as matrizes em triplicado corridas e nós processados ​​e analisados ​​dados usando o software GenEx Professional 5. Usando este protocolo, temos perfilado com sucesso microRNAs em vários tipos de linhas celulares e pilhas, CSF, plasma e tecidos embebidos em parafina fixadas em formalina.

Os resultados deste estudo foram publicados anteriormente 1. Figura 1 mostra os resultados da análise de microRNAs de referência candidatos usando o aplicativo geNorm. Por conseguinte, dois microRNAs, miR-622 e miR-1266, foram identificados como genes de referência e foram usadas para normalizar os valores de miRNA. Para o estudo CSF que tinha três grupos de amostras: VIH-(n = 10), COLMEIA (n = 4), e HIV + sem Encefalite (VIH +, n = ...

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Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

Nós descrevemos um protocolo de PCR em tempo real para o perfil de microRNAs no líquido cefalorraquidiano (LCR). Com a excepção dos protocolos de extracção de ARN, o procedimento pode ser estendido para o RNA extraído a partir de outros fluidos do corpo, as células cultivadas, ou amostras de tecido.

Líquido cefalorraquidiano MicroRNA perfil usando Quantitative PCR em Tempo Real

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

cerebrospinal-fluid-microrna-profiling-using-quantitative-real-time

Research

JoVE Journal

Medicine

15.3K visualizações.  LSU Health Sciences Center.  Nós descrevemos um protocolo de PCR em tempo real para o perfil de microRNAs no líquido cefalorraquidiano (LCR). Com a excepção dos protocolos de extracção de ARN, o procedimento pode ser estendido para o RNA extraído a partir de outros fluidos do corpo, as células cultivadas, ou amostras de tecido. 

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Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Avaliação de Captação de nanopartículas em tumores em tempo real usando imagens intravital

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Medicina

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

Detecção MicroRNA em tumores de próstata por Quantitative PCR em tempo real (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular patterns responsible for governing the movement performance. This motor learning can be enhanced through a number of methods that are utilized in research and clinical settings alike. In general, verbal feedback of performance in real-time or knowledge of results following movement is commonly used clinically as a preliminary means of instilling motor learning. Depending on patient preference and learning style, visual feedback (e.g. through use of a mirror or different types of video) or proprioceptive guidance utilizing therapist touch, are used to supplement verbal instructions from the therapist. Indeed, a combination of these forms of feedback is commonplace in the clinical setting to facilitate motor learning and optimize outcomes.
Laboratory-based, quantitative motion analysis has been a mainstay in research settings to provide accurate and objective analysis of a variety of movements in healthy and injured populations. While the actual mechanisms of capturing the movements may differ, all current motion analysis systems rely on the ability to track the movement of body segments and joints and to use established equations of motion to quantify key movement patterns. Due to limitations in acquisition and processing speed, analysis and description of the movements has traditionally occurred offline after completion of a given testing session.
This paper will highlight a new supplement to standard motion analysis techniques that relies on the near instantaneous assessment and quantification of movement patterns and the display of specific movement characteristics to the patient during a movement analysis session. As a result, this novel technique can provide a new method of feedback delivery that has advantages over currently used feedback methods.

Retraining abnormal movement patterns following injury or disease is a key component of physical rehabilitation. Recent advances in technology have permitted accurate assessment of movement during a variety of tasks, with near instantaneous quantification of results. This provides new opportunities for modification of faulty movement patterns in real time.

Movimento Reciclagem com feedback em tempo real do desempenho

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

Usando Quantitative PCR em tempo real para determinar enxerto célula dadora num modelo murino de osso Competitiva Marrow Transplantation

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with high-throughput cell positioning technology. The targeted tumor cell populations are first preprogrammed to immobilization into an array format, and labeled with green fluorescent cytosolic dyes. Following the cell array formation, antibody drugs are added in combination with human whole blood. Propidium iodide (PI) is then added to assess cell death. The cell array is analyzed with an automatic imaging system. While cytosolic dye labels the targeted tumor cell populations, PI labels the dead tumor cell populations. Thus, the percentage of target cancer cell killing can be quantified by calculating the number of surviving targeted cells to the number of dead targeted cells. With this method, researchers are able to access time-dependent and dose-dependent cell cytotoxicity information. Remarkably, no hazardous radiochemicals are used. The WCA presented here has been tested with lymphoma, leukemia, and solid tumor cell lines. Therefore, WCA allows researchers to assess drug efficacy in a highly relevant ex&#160;vivo condition.

The whole blood cytotoxicity assay (WCA) is a cytotoxicity assay developed by incorporating high-throughput cell positioning technology with fluorescence microscopy and automated image processing. Here, we describe how lymphoma cells treated with an anti-CD20 antibody can be analyzed real-time in human whole blood to provide quantitative cellular cytotoxicity analysis.

Em tempo real de Citotoxicidade em Sangue Total Humano

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic biomarkers. However, methods for quantitative proteomic characterization of patient-derived tumors and in particular their cellular subpopulations are largely lacking. Here we describe an experimental set-up that allows quantitative analysis of proteomes of cancer cell subpopulations derived from either liquid or solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry followed by bioinformatic data analysis. To enrich specific cellular subsets, liquid tumors are first immunophenotyped by flow cytometry followed by FACS-sorting; for solid tumors, laser-capture microdissection is used to purify specific cellular subpopulations. In a second step, proteins are extracted from the purified cells and subsequently combined with a tumor-specific, SILAC-labeled spike-in standard that enables protein quantification. The resulting protein mixture is subjected to either gel electrophoresis or Filter Aided Sample Preparation (FASP) followed by tryptic digestion. Finally, tryptic peptides are analyzed using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, and the data obtained are processed with bioinformatic software suites including MaxQuant. By means of the workflow presented here, up to 8,000 proteins can be identified and quantified in patient-derived samples, and the resulting protein expression profiles can be compared among patients to identify diagnostic proteomic signatures or potential drug targets.

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Quantitative Mass Spectrometric Profiling de proteomas de células do cancro da derivadas do líquido e tumores sólidos

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Real-time X-ray Imaging of Lung Fluid Volumes in Neonatal Mouse Lung

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting and sustaining this phenotype is critically important in normal alveolar growth and gas exchange throughout life. Several in vitro studies have characterized the role of key regulatory proteins, signaling molecules, and steroid hormones that can influence the rate of lung fluid clearance. However, in vivo examinations must be performed to evaluate whether these regulatory factors play important physiological roles in regulating perinatal lung liquid absorption. As such, the utilization of real time X-ray imaging to determine perinatal lung fluid clearance, or pulmonary edema, represents a technological advancement in the field. Herein, we explain and illustrate an approach to assess the rate of alveolar lung fluid clearance and alveolar flooding in C57BL/6 mice at post natal day 10 using X-ray imaging and analysis. Successful implementation of this protocol requires prior approval from institutional animal care and use committees (IACUC), an in vivo small animal X-ray imaging system, and compatible molecular imaging software.

We present a protocol to assess the rate of alveolar fluid clearance or pulmonary edema in neonatal mouse lung using X-ray imaging technology.

Imagens de raios-X em tempo real de pulmão volumes de fluido em Neonatal mouse Lung

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Avaliação de metástases pulmonares em Rato mamárias tumorais Models por Quantitative PCR em tempo real

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Isolamento e Caracterização do perfil de exossomas de bílis humana contendo MicroRNA-

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

Estendida Time-lapse Imagem intravital do Real-time multicelular Dynamics no microambiente tumoral

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...