Agradecemos programa IMAT Instituto Nacional do Câncer do NIH para financiar este trabalho [R33 CA174616-01A1].

1. Alvo celular Preparação <ol><li> Manter (por exemplo, células de linfoma. Raji) células alvo em meio de crescimento RPMI 1640 (meio de cultura, com 10% inactivado pelo calor de soro fetal bovino (FBS), L-glutamina 4 nM, e 500 UI / ml de penicilina / estreptomicina), a 37 ° C 5% num incubador de CO2. </li><li> Centrifuga-se a amostra para sedimentar as células-alvo em um tubo de 15 ml. Tempo de centrifugação varia de acordo com diferentes tipos de células; centrifuga-se durante 3 min a 468 xg durante células Raji. </li><li> Primeiro aspirar quaisquer bolhas formadas na superfície do sobrenadante, e remover todo o sobrenadante. </li><li> Adicionar 10 ml de PBS ao tubo. Re-suspender as células por pipetagem a solução para cima e para baixo várias vezes para quebrar o amontoado de células. </li><li> Centrifugar a amostra durante 3 minutos a 468 x g. </li><li> Aspirar as bolhas formadas na superfície do sobrenadante, e remover todo o sobrenadante. </li></ol> 2. Preparação de Microarrays celular <ol><li> Ofixação das células btain 96 kits placa bem ou conjunto de células 8 lâminas único bem de câmara (ver tabela de materiais / reagentes). </li><li> Aplicar 1,2 ul do Activador para o reagente de ADN a partir do kit. Tampe o frasco, invertê-lo, e agitar suavemente para misturar a solução. </li><li> Permitir que a solução a reagir durante 20 min à temperatura ambiente. </li><li> Aplicar a solução misturada ao sedimento de células alvo (no tubo de 15 ml). </li><li> Adicionar corantes de fluorescência verde citosólicas a uma concentração final de 500 nM. </li><li> Incubar as células-alvo com a solução mista e o corante durante 30 min à temperatura ambiente num agitador orbital. </li><li> Lavar as células duas vezes com 5 ml de PBS, e voltar a suspender as células em 10 ml de meios de crescimento. </li><li> Adicionar 100 ul da solução a partir do passo 2.7 em cada poço. Contar o número de células utilizando um hemacitómetro. Adicione os números de células certeza variar entre 5 × outubro 04-01 × 10 6 células por poço. </li><li> Após 10-15 min de incubação à temperatura ambiente, lavar suavemente as amostras duas vezes com 200-300 meio de crescimento ul para remover as células não ligadas. NOTA: Cerca de 5-10 ul de meio de crescimento permanece em cada poço após lavagem. </li></ol> 3. Sangue Total de Citotoxicidade <ol><li> Adicionar 180 ul de sangue humano inteiro para cada poço de amostra. </li><li> Obter solução de anticorpo anti-CD20, a 5 mg / ml, e realizar diluição em série para fazer 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5 ug / ml de solução de anticorpo anti-CD20 em tubos de 1,5 ml. Adicionar 20 ul de cada concentração do anticorpo anti-CD20 para cada poço de amostra tomada de triplicados. </li><li> Adicionar iodeto de propídio, a uma concentração final de 500 nM para cada poço. </li><li> Incubar a placa resultante a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 16 horas. </li><li> Imagem das células nas lâminas ou placas de 96 poços com um sistema automático de imagem com ampliação de 8X. </li><li> Use o programa de contagem de células do sistema de imagem automático para quantificar os resultados. NOTA: O software do sistema de imagens automático fornece simplespasso-a-passo para as operações de contagem das células. O protocolo de usar este software pode ser encontrado no site do provedor. </li><li> Selecione [Resultados revisão] da página principal do software. </li><li> Selecione [o arquivo salvo para as amostras]. </li><li> Primeiro portão FITC intensidade média&gt; 50, então portão TxRed intensidade&gt; 20 significam. </li><li> Selecione [Placa Overview]. </li><li> Selecione [Tabelas de exportação]. NOTA: A fórmula de morte celular percentagem do programa é mostrada abaixo: Assassinato% célula-alvo = (número de células coradas tanto verde e vermelho / # de células coradas verde) * 100% </li></ol>

<ol>
	<li>Hutchinson, L., Kirk, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+drug+attrition+rates--where+are+we+going+wrong.">High drug attrition rates--where are we going wrong.</a> Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).</li><li>Moreno, L., Pearson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attrition+rates+be+reduced+in+cancer+drug+discovery.">Attrition rates be reduced in cancer drug discovery.</a> Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).</li><li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+Host+Response+to+Injury,+Large+Scale+Collaborative+Research+Program.+Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Inflammation and Host Response to Injury, Large Scale Collaborative Research Program. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3507-3512 (2013).</li><li>Suntharalingam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+storm+in+a+phase+1+trial+of+the+anti-CD28+monoclonal+antibody+TGN1412.">Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412.</a> N Engl J Med. 355, 1018-1028 (2006).</li><li>Eastwood, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+TGN1412+trial+failure+explained+by+species+differences+in+CD28+expression+on+CD4++effector+memory+T-cells.">Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells.</a> Br J Pharmacol. 161, 512-526 (2010).</li><li>Hsiao, S. C., Liu, H., Holstlaw, T. A., Liu, C., Francis, C. Y., Francis, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+assays+for+quantifying+cytotoxicity+with+single+cell+resolution.">Real time assays for quantifying cytotoxicity with single cell resolution.</a> PLoS One. 8, 10-1371 (2013).</li><li>Wang, S. Y., Weiner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rituximab:+a+review+of+its+use+in+non-Hodgkin&#8217;s+lymphoma+and+chronic+lymphocytic+leukemia.">Rituximab: a review of its use in non-Hodgkin&#8217;s lymphoma and chronic lymphocytic leukemia.</a> Expert Opin Biol Ther. 8, (2008).</li><li>Dalle, S., Thieblemont, C., Thomas, L., Dumontet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+in+clinical+oncology.">Monoclonal antibodies in clinical oncology.</a> Anticancer Agents Med Chem. 8, 523-532 (2008).</li><li>Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assay+of+the+lytic+action+of+immune+lymphoid+cells+on+51-Cr-labelled+allogeneic+target+cells+in+vitro;+inhibition+by+isoantibody+and+by+drugs.">Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs.</a> Immunology. 14, 181-196 (1968).</li><li>Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-release+assay+for+natural+cytotoxicity.">An enzyme-release assay for natural cytotoxicity.</a> J Immunol Methods. 64, (1983).</li><li>Gerlier, D., Thomasset, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+MTT+colorimetric+assay+to+measure+cell+activation.">Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation.</a> Immunol Methods. 94, 57-63 (1986).</li><li>Toriello, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+microfluidic+bioprocessor+for+single-cell+gene+expression+analysis.">Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (2008).</li><li>Douglas, E. S., Hsiao, S. C., Onoe, H., Bertozzi, C. R., Francis, M. B., Mathies, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-barcode+directed+capture+and+electrochemical+metabolic+analysis+of+single+mammalian+cells+on+a+microelectrode+array.">DNA-barcode directed capture and electrochemical metabolic analysis of single mammalian cells on a microelectrode array.</a> Lab on a Chip. 9, 2010-2015 (2008).</li><li>Mayr, L. M., Bojanic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+trends+in+high-throughput+screening.">Novel trends in high-throughput screening.</a> Current opinion in pharmacology. 9, 580 (2009).</li><li>Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening:+seeing+is+believing.">High content screening: seeing is believing.</a> Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).</li><li>Coelho, J., P, L., Quinn, S., Murphy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image+analysis+for+high-content+screening+and+analysis.">Automated image analysis for high-content screening and analysis.</a> J Biomol Screen. 15, 726-734 (2010).</li><li>Sundberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+ultra-high-throughput+screening:+solution-+and+cell-based+approaches.">High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches.</a> Current Opinion in Biotechnology. 11, 47 (2000).</li><li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+medicine+is+more+than+genomic+medicine:+confusion+over+terminology+impedes+progress+towards+personalized+healthcare.">Personalized medicine is more than genomic medicine: confusion over terminology impedes progress towards personalized healthcare.</a> PERS MED. 9, 85 (2012).</li></ol>

Autores não têm interesses financeiros concorrentes.

WCA é uma crítica em ferramenta de triagem anti-câncer vitro com resolução única célula 12-16, idealmente utilizado após exames alvo tradicionais, como o CDC e ensaios ADCC 11/09, e antes de testes em animais pré-clínicos. Atualmente, alvo primário testes de rastreio, como CDC ou ensaios ADCC são todos realizados em uma mídia simplificado ou um sistema de buffer. No entanto, os candidatos de droga que mostram eficácia no sistema tampão simplificada estes nem sempre ...

Recentes avanços na indústria farmacêutica têm levado a um aumento do interesse em realizar as identificações específicas de anticorpos contra as células do tumor e tratamentos personalizados de câncer; No entanto, vários obstáculos são encontrados no processo. Apenas 5% dos agentes que têm actividade anti-cancerígena em desenvolvimento pré-clínico são licenciados depois de mostrar eficácia suficiente em fase de testes II-III 1,2. As estratégias de pré-clínicos (tanto in vitro como in vivo) são sub-óptima como muitos exemplos têm mostrado que os medicamentos anti-tumorais se comportam de maneira diferente em humanos e em animais de laboratório, principalmente devido aos seus diferentes componentes do sangue de 3-5. Para abordar a necessidade de uma plataforma de rastreio de drogas anti-tumor e para fornecer um ponto de verificação antes de experiências com animais e ensaios clínicos dispendiosa, um ensaio de citotoxicidade de sangue total humano (WCA) é proposto para avaliar a eficácia do fármaco anti-tumoral num ambiente biológico mais relevante. Oensaio de citotoxicidade de sangue total pode ser utilizada para avaliar a resposta de células individuais de anticorpos e outros candidatos a fármacos no sangue humano inteiro. A WCA é desenvolvido através da incorporação de tecnologia de alto rendimento posicionamento de células com alta taxa de transferência e de alto teor de imagem 6. Através da utilização de um sistema de imagem automatizado, o número de ambas as células vivas e mortas pode ser determinada com um elevado grau de precisão. Devido ao facto de que as células-alvo são imobilizadas no mesmo plano focal, WCA é capaz de fornecer uma análise quantitativa citotoxicidade em tempo real, sem a remoção de células vermelhas do sangue. Além disso, o sistema de imagem automática, oferece várias vantagens, como a que apenas as células-alvo que atingiram os critérios especificados (ex., Células com marcação fluorescente, e morfologia das células) são fechados e processados. Além disso, ele permite a produção de placas de 144 por dia. Consequentemente, esta capacidade de imagem e taxa de transferência permite um funcionamento de alta content e experiências de alto rendimento simultaneamente. Ao combinar WCA eo sistema de imagem automatizado, alto rendimento análise de citotoxicidade celular quantitativa pode ser alcançada dentro de um ambiente mais relevante biológica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="761">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:172px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:135px;">Name/Discription</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:336px;">Cell attachment 96 well plate kits&#160;</td>
			<td style="width:172px;">Adheren</td>
			<td style="width:119px;">AP9601</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:336px;">Suspension Single cell array 8 well chamber slide</td>
			<td style="width:172px;">Adheren</td>
			<td style="width:119px;">SS0801</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:336px;">Adherent Single cell array 8 well chamber slide</td>
			<td style="width:172px;">Adheren</td>
			<td style="width:119px;">SS0802</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Lymphoma cell line CD20+</td>
			<td style="width:172px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL-86</td>
			<td style="width:135px;">Raji cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Lymphoma cell line CD20-</td>
			<td style="width:172px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-8083</td>
			<td style="width:135px;">MC/CAR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11875-119</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:172px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">SH30070.01HI</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Peni/Strep</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15070063</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Cytosolic dye</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C7025</td>
			<td style="width:135px;">Cell Tracker Green</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Rituxan (Biosimilar)&#160;</td>
			<td style="width:172px;">Eureka Therapeutics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Human whole blood</td>
			<td style="width:172px;">Allcells</td>
			<td style="width:119px;">WB001</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4170-10MG</td>
			<td style="width:135px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Automatic imaging system</td>
			<td style="width:172px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">Contact Vendor</td>
			<td style="width:135px;">Cell Reporter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Cell counting program</td>
			<td style="width:172px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">Contact Vendor</td>
			<td style="width:135px;">Cell Reporter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time cytotoxicity assays in human whole blood

Um ensaio baseado em células vivo de sangue total citotoxicidade (WCA) que permite o acesso à informação temporal da citotoxicidade celular global é desenvolvida com a tecnologia de alto rendimento de posicionamento de célula. As populações de células tumorais alvo são primeiro pré-programado para imobilização num formato de array, e marcadas com corantes fluorescentes verdes citosólicas. Na sequência da formação de matriz celular, drogas de anticorpo são adicionados em combinação com sangue total humano. Iodeto de propídio (PI) é então adicionado para avaliar a morte celular. A matriz de células é analisado com um sistema de imagem automática. Embora as etiquetas corante citosólica populações de células tumorais visadas, as etiquetas PI populações de células tumorais mortas. Assim, a percentagem de morte de células de cancro alvo pode ser quantificada por cálculo do número de células sobreviventes direccionadas para o número de células alvo mortas. Com este método, os pesquisadores são capazes de acessar dependente do tempo e informações citotoxicidade celular dependente de dose. Notavelmente, sem rádio perigososprodutos químicos são utilizados. O WCA aqui apresentada foi testado com linfoma, leucemia e linhas celulares de tumores sólidos. Portanto, WCA permite aos pesquisadores para avaliar a eficácia da droga em uma condição altamente relevante ex vivo.

Anti-CD20 Os anticorpos e células de linfoma (células Raji e MC / CAR) foram escolhidos como um sistema modelo para demonstrar o ensaio de citotoxicidade de sangue total (WCA) 7,8. Células Raji teve alta do número de cópias de CD20 na superfície celular, enquanto que as células MC / CAR tinha baixo número de cópias de CD20 na sua membrana. Células-alvo foram coradas primeiro verde com corantes de fluorescência citossólicas verdes e formou na placa de 96 poços. 10.000 - 50.000 células de linfoma ...

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Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

O ensaio de citotoxicidade de sangue total (WCA) é um ensaio de citotoxicidade desenvolvido mediante a incorporação de alto rendimento tecnologia de posicionamento de célula com microscopia de fluorescência e de processamento de imagem automatizado. Aqui, nós descrevemos como células de linfoma tratadas com um anticorpo anti-CD20 pode ser analisada em tempo real no sangue humano inteiro para fornecer uma análise quantitativa da citotoxicidade celular.

Em tempo real de Citotoxicidade em Sangue Total Humano

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

real-time-cytotoxicity-assays-in-human-whole-blood

Research

JoVE Journal

Medicine

12.1K visualizações.  Adheren, Inc.  O ensaio de citotoxicidade de sangue total (WCA) é um ensaio de citotoxicidade desenvolvido mediante a incorporação de alto rendimento tecnologia de posicionamento de célula com microscopia de fluorescência e de processamento de imagem automatizado. Aqui, nós descrevemos como células de linfoma tratadas com um anticorpo anti-CD20 pode ser analisada em tempo real no sangue humano inteiro para fornecer uma análise quantitativa da citotoxicidade celular. 