This work was supported by the KU Leuven PF &#8216;IMIR&#8217;, the FWO Research community on biology and ecology of bacterial and fungal biofilms (FWO: WO.026.11N) and by the FWO project G.0804.11. SK gratefully acknowledges KU Leuven for the PDMK 11/089 fellowship and FWO for the postdoctoral fellowship. We are grateful to Nico Vangoethem for his assistance with preparation of the figures. We would like to acknowledge Celia Lobo Romero for technical assistance during in vivo experimental procedures.

NOTA: Todas as experiências com animais foram aprovados pelo comitê de ética da KU Leuven (número do projeto 090/2013). Manter animais em conformidade com as orientações de cuidados de animais KU Leuven. 1. C. Crescimento albicans <ol><li> Vinte e quatro horas antes do início da experiência animal, para preparar as placas de YPD por adição de 10 g de extracto de levedura granulado, 20 g de peptona bacteriológica, e 15 g de agar granulado. Certifique-se o volume para 900 ml com água Milli-Q e autoclave. </li><li> Adicionar 50 ml de estéril de glicose a 40%. Misture bem e despeje em placas de Petri. Deixar placas de agar para esfriar e solidificar. NOTA: Neste estudo, use duas linhagens, ou seja, do tipo selvagem C. albicans SC5314 - Gluc tensão negativa (referido como WT) e C. albicans estirpe SKCA23, que é um tipo selvagem C. albicans SC5314 transformada com Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmídeo 22 .Neste estirpe (nomeado SKCA23- ACTgLuc) gluc foi fundida com o gene endógeno PGA59 sob o controlo de ACT1 (actina) promotor (isto é promotor activo na levedura, bem como fase de crescimento de hifas de fungos). Esta variedade pode ser solicitado ao laboratório do Prof. Patrick Van Dijck, KU Leuven, Leuven, na Bélgica. Plasmídeo Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmídeo 22 foi gentilmente doado pelo Prof. C. d&#39;Enfert, Instituto Pasteur, Paris, França. </li><li> Manter ambas as estirpes em stock glicerol e armazenar a -80 ° C. </li><li> Antes de todas as estirpes experimento raia numa placa de YPD. Incubar a placa a 37 ° C durante a noite. </li></ol> 2. Cateter Pieces Preparação <ol><li> Antes do experimento, determinar quantos cateteres são necessários. É possível implantar até 6 partes de cateter por ratinho (3 cateteres no lado esquerdo e 3 do cateter no lado direito do animal (Figura 2A). </li><li> Vinte e quatro horas antes da cirurgia animal, abra o pacoteidade contendo cateter triplo-lúmen sob a cabine de segurança biológica. Remova todas as peças desnecessárias com pinças estéreis e cortar a parte ligada ao cateter com um bisturi estéril. Coloque governante no âmbito do pacote de plástico e cortar pedaços de cateter de poliuretano de exatamente um centímetro de acordo com a escala da régua (Figura 1). NOTA: É importante mencionar que este tipo de peça cateter não é fosforescente e, portanto, adequado para BLI 18,19. </li><li> Coloque um máximo de 15 peças de corte de cateter (passo. 2.2) em 2 ml microtubos. Sempre preparar 3 peças adicionais, que são usadas para enumerar a quantidade de células de Candida em anexo no dispositivo após o período de adesão. </li><li> Suplemento cateteres com aproximadamente 1,8 ml de 100% de soro fetal bovino (FBS). </li><li> Vortex vigorosamente e adicionar adicional 100-200 ul de 100% de FBS. Cobrir completamente todas as peças de cateter com soro. </li><li> Incubar a 37 ° C durante a noite. </li&gt; </ol> 3. Animais e supressão do sistema imunitário <ol><li> Mantenha feminino camundongos BALB / c (cerca de 8 semanas de idade) no topo gaiolas com filtro ventilado individualmente com acesso livre à comida padrão e água ad libitum. </li><li> Iniciado supressão do sistema imunológico 24 horas antes da cirurgia de animais adicionando dexametasona (0,4 mg / L) na água de beber dos animais. A fim de evitar qualquer contaminação bacteriana do hospedeiro, completar a água potável com antibiótico, por exemplo, pó de ampicilina de sódio (0,5 g / L). </li><li> Manter imunossupressão dos animais durante toda a experiência (até 6 dias). </li></ol> 4. Substratos poliuretano ex vivo C. albicans Aderência em FBS revestidas <ol><li> Transferir cada peça cateter revestido de soro para um tubo de 1,5 mL de microcentrífuga fresco. </li><li> Raspe alguns C. albicans células cultivadas em placas de YPD (Passo 1) e suspendê-las em 1 ml de PBS. </li><li> Diluir Candida células (1: 100) em um tubo de microcentrífuga separados. Tomar 10 ml da amostra diluída e aplicá-lo em uma câmara de contagem de células. Contagem pelo menos 16 pequenos quadrados. </li><li> Preparar as células de Candida (cada estirpe em separado) em meio RPMI 1640 para uma concentração final de 5 x 10 4 células / ml. </li><li> Adicionar 1 ml de suspensão de células a cada pedaço do cateter revestido de soro. </li><li> Vigorosamente vórtice e garantir que os cateteres estão submersos no meio e não flutuando em cima. </li><li> Incubar cateteres em 37 ° C durante 90 min (tempo de adesão). </li><li> Remover cateteres com pinças estéreis e lavar duas vezes com 1 ml de PBS. Durante esta etapa, certifique-se de que o líquido de lavagem passa através do lúmen, mantendo o cateter em posição vertical durante a lavagem muito suavemente os cateteres. É importante notar que não utilize um fluxo forte que pode conduzir à eliminação de células ligadas. </li><li> Transferência de cada cateter lavada para um tubo de microcentrífuga limpo (uma peça por tuser). </li><li> Coloque no gelo e manter lá até a cirurgia. </li></ol> 5. Anestesia <ol><li> Prepare a anestesia por mistura de 75 ul de cetamina (100 mg / ml) com 100 ul de medetomidina (1 mg / ml) e 825 ul de solução salina estéril. Administrar por via intraperitoneal (ip) de 60-80 ul de coquetel de anestésico por 10 g de peso corporal, o que resulta em uma dose de 45-60 mg / kg de cetamina e 0,6-0,8 mg / kg de medetomidina. </li><li> Para inversão da anestesia, diluir 50 ul atipamezol (5 mg / ml) em 4,95 ml de solução salina, administrar ip 100 ul por 10 g de peso corporal como antídoto, resultando numa dose de 0,5 mg / kg. </li><li> Após a injeção de anestesia, colocar o animal em uma gaiola separada e esperar até que esteja totalmente adormecido. </li><li> Confirme anesthetization adequada do animal por pitada pele clara e pitada toe, que não causam qualquer dano à pele. Qualquer movimento observado indica que o animal não é suficientemente anestesiados para realizar a cirurgia. Se isso acontecer, espere um couple de minutos a mais até que o animal não mostra qualquer sinal de movimento sobre a pele ou toe pitada. </li></ol> 6. Cirurgia animal <ol><li> Transferência anestesiados animal a partir da gaiola sobre um tecido limpo colocado sobre a almofada de aquecimento, pré-aquecido a 37 ° C (Figura 2A, (1)). NOTA: Uma alternativa mais barata é usar cobertores elétricos. É também possível a utilização de almofadas de isotérmicas, que deve ser aquecido no forno de microondas, antes da cirurgia animal. </li><li> Aplicar pomada oftálmica para os olhos. </li><li> Raspar a parte inferior das costas do animal com um barbeador elétrico. Remova todos os pêlos de animais e transferir animais em um tecido limpo. Desinfecção da pele (por exemplo, com 1% de isopropanol iodo ou clorexidina 0,5% em álcool a 70%) e deixar a área desinfectada para secar durante cerca de 1 min (Figura 2A, (2)). </li><li> Fazer uma pequena incisão na pele (um à esquerda e uma no lado direito do animal) (aproximadamente 0,5 &amp;# 8211; 1 cm) (Figura 2A, (3)). </li><li> Dissecar o tecido subcutâneo com uma tesoura para criar dois túneis subcutâneos. Cada túnel deve ser de aproximadamente 1,5 centímetros de comprimento e 1 cm de largura. </li><li> Insira três peças cateteres, previamente infectados com Candida, em cada túnel. Certifique-se de que os cateteres caber ao lado uns dos outros numa disposição horizontal, e que eles não cobrem o outro para permitir a implantação de seis fragmentos de cateter no total (Figura 2A, (4)). </li><li> Feche as incisões com suturas. Alternativamente, usar Dermabond para fechar a ferida. </li><li> Desinfectar a ferida muito suavemente com 0,5% de cloro-hexidina em 70% de álcool ou de isopropanol com iodo (1%). </li><li> Aplicar anestésico local (xilocaína gel, 2%) directamente na ferida. </li><li> Administrar reversão da anestesia (protocolo de 5, passo 2): por via intraperitoneal 100? L por 10 g de peso corporal. </li><li> Transferência dos animais a uma gaiola limpa previamente colocados sobre uma placa de aquecimento. Mantenha o animalseparado e quente até que o animal está completamente acordado. Enquanto isso, continue com a operação e implante do próximo animal. Uma vez que todos os animais operados está totalmente acordado. Transfira para uma gaiola. Monitorar os animais regularmente. </li></ol> 7. A bioluminescência Imagem: Preparação de celenterazina (CTZ), o substrato para G. luciferase princeps <ol><li> Preparar fresco coelenterazina (CTZ) solução estoque por dissolução de 5 mg / ml em etanol acidificado CTZ ou de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Preparar a solução de trabalho de 1,2 mM, por diluição da solução de reserva de 1:10 em PBS estéril. NOTA: injectar 100 ul CTZ soluções de trabalho por via subcutânea na área em torno dos cateteres. Use seringas de insulina por injecção subcutânea de CTZ. </li><li> Sempre mantenha CTZ no escuro (por exemplo, cobrir microtubos contendo CTZ com folha de alumínio). Guardar a solução estoque a -80 ° C durante a duração das experiências. </li></ol&gt; 8. A bioluminescência Imagem <ol><li> Inicializar a câmera BLI. </li><li> Anestesiar os animais utilizando uma caixa de indução. Utilize uma mistura gasosa de isofluorano em oxigénio, N 2 O / O 2, ou ar em 2-3%. </li><li> Após a indução, manter a anestesia na caixa de indução e na câmara de imagem em 1,5-2%. </li><li> Antes de iniciar a sessão de imagem, colocar a placa de imagiologia, na posição A, que corresponde a um campo de visão de 10 cm. Certifique-se que a posição correta dos pontos de venda de anestesia e os animais, colocando um animal dormir na caixa. </li><li> Tire algumas fotografias até que animal é na posição de imagem desejada, no campo de visão direita sob a câmera. </li><li> Prepare duas seringas de insulina, cada um contendo 100 ul da solução de trabalho CTZ. </li><li> Coloque um animal no banco e mantê-lo no sono por meio de um cone do nariz proporcionando anestesia gás. </li><li> Traga as agulhas das seringas num local circundante cateteres e injectar subcutaneamenteo CTZ simultaneamente no topo dos cateteres. </li><li> Imediatamente após a injeção, coloque o animal na chapa quente na caixa de câmera e começar a aquisição de imagem de bioluminescência. </li><li> Adquirir verificações consecutivas com tempos de aquisição que variam de 20 a 60 segundos (dependendo da intensidade do sinal) até que a intensidade máxima do sinal é alcançado. Durante a aquisição do quadro seguinte, medir a intensidade de sinal BLI dos quadros previamente adquiridos pela colocação de um ROI sobre cada trio cateteres e medindo o fluxo de fotões através desta ROI. </li><li> Repita a partir do passo 7 para o animal seguinte (s). </li><li> Depois de imagem, retornar os animais para sua gaiola. Repita BLI durante o curso de um experimento para longitudinal, não-invasivo follow-up de formação de biofilme. </li><li> Analisar os dados BLI usando Viver software de imagem. Coloque um ROI retangular de tamanho fixo em cada trio cateter e medir o fluxo de fótons (radiação) por cada ROI. Repita esse procedimento para cada animal. </li><li> Relatórioa intensidade do sinal de cada BLI trio cateter como fluxo de fótons por segundo. Representam os dados BLI numa escala logarítmica através da representação gráfica da média e desvio padrão de fluxo de fotões por segundo para cada grupo. Realizar análise estatística sobre os log 10 dados transformados. </li></ol> 9. Cateter Explant <ol><li> Preparar tubos de microcentrífuga contendo 1 ml de PBS, uma para cada dispositivo de cateter e mantê-los em gelo. </li><li> Eutanásia dos animais por deslocamento cervical (Figura 2B, (1)). </li><li> Desinfecção da pele do dorso com 0,5% de cloro-hexidina em 70% de álcool ou com isopropanol iodo (1%). </li><li> Realizar uma incisão (cerca de 3 cm) acima dos cateteres. </li><li> Corte o tecido subcutâneo e remover os fragmentos de cateter, um por um de debaixo do tecido subcutâneo utilizando pinças estéreis (Figura 2B, (2)). </li><li> Pega cateter suavemente na posição vertical e lavá-lo duas vezes com 1 ml de PBS estéril. Coloque cada cateterpedaço para um tubo de microcentrífuga separados (preparado na Fase 1). </li></ol> 10. As células A quantificação do biofilme-associados por Formadoras de Colônias Conde Units (UFC) e Análise estatística dos resultados <ol><li> Sonicar cateteres colocados previamente em 1 ml de PBS durante 10 min a 40.000 Hz, em um banho de água sonicador e colocá-los em gelo. </li><li> Depois de ultra-sons, vigorosamente vortex por 30 segundos e coloque novamente no gelo. </li><li> Preparar dois tubos de microcentrífuga adicionais contendo 900 ul de PBS. </li><li> Adicione 1:10 e 1: 100 a partir de diluições sua amostra original (aquele que contém o cateter) e manter todos os tubos de microcentrífuga em gelo. </li><li> Placa de 100 ul das amostras originais, 1:10 e 1: 100 diluições em placas de YPD-agar em duplicado. </li><li> Incubar as placas durante 2 dias a 37 ° C e contagem de UFC. </li><li> Contar as colônias cultivadas em placas de ágar YPD (valor contábil de colônias, máximo de 300 colônias / placa) e multiplicá-los pelo bom Dilufator mento (1x-original, 10x ou diluição 100x). Além disso multiplicar cada pedaço de cateter por 10x, o que corresponde ao valor final das colônias em um tubo ml contendo o cateter. Traga o montante final das colônias para log 10 células / pedaço de cateter com desvio padrão (SD). Expresso de dados como a média ± SD. </li><li> Coloque todos os valores para cada cateter e grupo específico para um programa de folha de cálculo e / ou estatístico, para realizar os cálculos e as análises estatísticas acima mencionados. Indique grupos específicos para comparar, ou seja, WT vs. mutante ou 2 dias vs. 6 dias de formação de biofilme e realizar teste t não pareado e ANOVA com pós-teste de Tukey com os dados transformado-log10. <ol><li> Expresse o nível de significância por um valor de p. Neste estudo indicam significância, se o valor de p &lt;0,05, representado como se segue: * p &lt;0,05, ** p &lt;0,005, *** p &lt;0,0005. </li></ol></li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O uso de modelos animais, e modelos especialmente roedores, para estudos dedicados a biofilmes microbianos é muito importante porque o sistema imune do hospedeiro é um fator essencial na formação de biofilme que modelos in vitro não pode dar conta. Neste estudo, descrevemos um C. subcutânea relativamente simples albicans modelo biofilme rato, que pode ser facilmente adotada em um laboratório de pesquisa e não requer habilidades técnicas fortes. Este modelo foi inicialmente desenvolvid...

Cândida albicans é um organismo comensal, que pode ser encontrada em diferentes locais de indivíduos saudáveis, por exemplo sobre a pele ou como uma parte do tracto gastrointestinal e a flora vaginal. No entanto, em hospitalizados, e especialmente pacientes imunocomprometidos, pode causar uma grande variedade de infecções 1. Nesses indivíduos, o sistema imunológico enfraquecido permite que as células de Candida de divulgar para a corrente sanguínea e invadir tecidos mais profundos causando infecções potencialmente fatais. Além disso, a presença de substratos abióticas, tais como cateteres venosos centrais e urinários, válvulas cardíacas artificiais, e as juntas podem proporcionar um nicho para Candida de fixação 2. Adesão ao tais substratos é um pré-requisito para um maior desenvolvimento de biofilme, o que representa uma camada de levedura e hifas células embutidos em material polimérico extracelular, que consiste principalmente de polissacarídeos 2. C. cateter -associated infecções albicansestão associados a alta taxa de mortalidade. A característica geral de biofilmes é a sua sensibilidade diminuída ao antifúngicos conhecidos, tais como azoles 3,4. Apenas as classes mais novas de drogas antifúngicas, como equinocandinas e formulação lipossomal da anfotericina B mostrou-se ativa contra as infecções associadas ao uso de cateter 5-7. Por causa do biofilme resiliência aos antifúngicos, abordagens terapêuticas são muito limitados, muitas vezes levando a remoção do cateter e sua posterior substituição como uma solução única. A maioria de nossa compreensão atual do C. albicans desenvolvimento do biofilme se origina a partir de estudos in vitro sobre substratos abióticas, tais como poliestireno, ou plásticos utilizados para o fabrico dos dispositivos acima mencionados, ou seja, silicone, poliuretano 2. Estes modelos são bastante avançado e tentar simular a situação in vivo, tanto quanto possível. No entanto, estes sistemas não envolvem o fluxo sanguíneo contínuo e tele sistema imune do hospedeiro. Isto resultou no desenvolvimento de sistemas modelo in vivo, tais como o modelo de cateter venoso central (CVC) 8-10, o modelo de estomatite dentadura candidíase oral 11 e um modelo murino para associada a cateter candidúria 12. Além disso, C. albicans desenvolvimento de biofilme foi estudado in vivo sobre as superfícies das mucosas, tais como aqueles a partir da vagina 13 e cavidade oral 14. Nosso laboratório contribuiu com a criação de um C. subcutânea albicans modelo biofilme, que se baseia no implante de peças cateter infectados no dorso de ratos Sprague-Dawley 15. Este modelo foi utilizado com sucesso em nosso laboratório para testar a suscetibilidade biofilme ao fluconazol ea equinocandina drogas 5,16, para estudar o efeito da terapia combinatória de diclofenaco e caspofungin 17. Mais recentemente, este sistema adaptado para utilização em ratinhos BALB / c 18,19. Emcomparação com outros modelos in vivo, a principal vantagem deste modelo subcutânea é a possibilidade de estudar vários biofilmes por animal desenvolvido no interior do lúmen do cateter implantado peças. Para reduzir o número de animais de laboratório, que se adaptaram este modelo para estudar o desenvolvimento de C. albicans biofilmes não-invasiva usando imagem de bioluminescência (BLI) 18,19. Este método provou ser uma técnica poderosa que pode ser utilizada para quantificar os biofilmes medindo o sinal específico BLI na região de interesse (no nosso caso, a área de cateteres implantados), evitando-se o sacrifício dos animais. Em comparação com as bactérias, o que pode expressar o gene e o substrato necessário para a reacção de bioluminescência devido à introdução de um operão lux específico 20, a maioria dos organismos eucariotas, incluindo C. albicans, são dependentes da expressão heteróloga de um gene da luciferase, juntamente com oadministração externa de um substrato específico, tal como D-luciferina ou coelenterazina 21. Provavelmente devido à presença da parede da célula fúngica e C. morfogénese albicans, a entrega intracelular do substrato para a enzima luciferase foi um desafio principal 21. A fim de resolver este problema, Enjalbert et al. 22 de engenharia em que uma estirpe de um C. sintético albicans versão optimizada do codão para o gene naturalmente secretada Gaussia princeps luciferase (GLIC) foi fundida com a da C. gene albicans PGA59, um GPI- ancorada proteínas da parede celular. Devido à presença de luciferase na parede celular, problemas de disponibilidade intracelular do substrato pode ser evitada. Este sistema em particular foi utilizado para estudar as infecções superficiais causadas por C. albicans 22. Muito recentemente, a BLI também foi utilizado para seguir a progressão da candidíase orofaríngea e a sua postratamento e 23. Tais resultados suportam o uso de BLI como uma técnica promissora para estudar infecções causadas por células de vida livre, mas também infecções associadas aos dispositivos. Neste estudo, descrevemos a C. albicans desenvolvimento de biofilme em peças de cateter de poliuretano em camundongos BALB / c e sua quantificação usando BLI. Nós fornecer um protocolo detalhado de colonização in vitro de cateteres de poliuretano durante o período de adesão, seguido pela implantação em ratinhos e subsequente desenvolvimento de biofilme em animais vivos. Para além de medir o sinal emitido pelo BLI C. células albicans, nós também determinar a unidades formadoras de colónias de comparação com a técnica padrão para biofilme fúngico carga quantificação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="877">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Name of Reagent</td>
			<td style="width:199px;">Company</td>
			<td style="width:113px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:236px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Yeast extract granulated</td>
			<td style="width:199px;">Merck</td>
			<td style="width:113px;">MERC1.03753.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Bacteriological peptone</td>
			<td style="width:199px;">Oxoid</td>
			<td style="width:113px;">LP037B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Agar granulated</td>
			<td style="width:199px;">Difco</td>
			<td style="width:113px;">214530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">D-(+)-glucose</td>
			<td style="width:199px;">Fluka</td>
			<td style="width:113px;">49159-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Prepared in the laboratory</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">R6504-1L</td>
			<td>Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">M1254</td>
			<td>MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730)&#160;</td>
			<td style="width:199px;">BBraun</td>
			<td style="width:113px;">CV-15703</td>
			<td>Polyurethane part cut into 1 cm pieces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:199px;">Fagron SAS, France</td>
			<td style="width:113px;">611139</td>
			<td>Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Duchefa Biochemie, The Netherlands</td>
			<td style="width:113px;">A0104</td>
			<td>Antibacterial prophylaxis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Ketamine 1000</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td style="width:113px;">804 119</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Domitor</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td style="width:113px;">134737-1</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Antisedan</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td style="width:113px;">134783-2</td>
			<td>Reversal of anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Xylocaine gel (2%) - this is Linisol</td>
			<td style="width:199px;">AstraZeneca</td>
			<td style="width:113px;">352 1206</td>
			<td>Local anesthetic for the skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>To prevent drying and infection of eyes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Coelenterazine&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Prolume (Nanolight)</td>
			<td style="width:113px;">NF-CTZ-FB</td>
			<td>Light sensitive agent (must be kept in the dark)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodine isopropanol (1%)</td>
			<td style="width:199px;">3M&#8482; DuraPrep&#8482;&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Disinfectant for the skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol.&#160;&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Cedium</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Disinfectant for the skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Equipment</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Cell counting chamber</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Insulin syringes (0.3 ml)</td>
			<td style="width:199px;">Terumo Myjector 29G</td>
			<td style="width:113px;">324826</td>
			<td>For injection of coelenterazine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Electric razor</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>For small animals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Sterile surgical tools</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Heating pad</td>
			<td style="width:199px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;">14042321474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Skin suture</td>
			<td style="width:199px;">Johnson&#38;Johnson</td>
			<td style="width:113px;">K890H</td>
			<td>Surgical thread, needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath sonicator</td>
			<td>Branson 2210</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">BLI camera (IVIS Spectrum)&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Perkin Elmer, Alameda</td>
			<td style="width:113px;">IVISSPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Living Image software&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Perkin Elmer, Alameda</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>(version 4.2)&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging

Candida albicans desenvolvimento de biofilmes em superfícies bióticos e / ou abióticos representa uma ameaça específica para os pacientes hospitalizados. Até agora, C. albicans biofilmes foram estudadas in vitro, mas predominantemente existe uma necessidade importante para uma melhor compreensão deste processo dinâmico em condições in vivo. Desenvolvemos um modelo de rato in vivo subcutânea para estudar C. formação de biofilme albicans. No nosso modelo, múltiplo (até 9) infectados com Cândida dispositivos são implantados para a parte de trás do animal. Isso nos dá uma grande vantagem sobre o sistema modelo de cateter venoso central, uma vez que nos permite estudar vários biofilmes independentes em um animal. Recentemente, nós adaptamos este modelo para estudar C. albicans desenvolvimento de biofilmes em ratinhos BALB / c. Neste modelo, amadurecer C. biofilmes albicans desenvolver dentro de 48 horas e demonstrar a arquitetura típica biofilme tridimensional. A quantificação de biofilme fúngicaé tradicionalmente analisada post mortem e exige sacrifício host. Uma vez que este requer o uso de muitos animais para realizar estudos cinéticos, aplicou-se a bioluminescência de imagem não invasiva (BLI) longitudinalmente para acompanhar amadurecem in vivo C. albicans biofilmes em desenvolvimento em nosso modelo subcutâneo. C. albicans células foram manipuladas para expressar o gene da luciferase princeps Gaussia (GLIC) ligado à parede celular. O sinal de bioluminescência é produzido pela luciferase que converte o substrato coelenterazina adicionada a luz que pode ser medida. O sinal BLI se assemelhava a contagem de células obtidas de cateteres explantados. Imagem não invasivo para a quantificação da formação de biofilme vivo fornece aplicações imediatas para a triagem e validação de drogas antifúngicas em condições in vivo, bem como para estudos baseados em interações patógeno-hospedeiro, vem contribuindo para uma melhor compreensãoing da patogenia das infecções associadas ao uso de cateter.

Neste estudo, nós mostramos o procedimento cirúrgico de implante do cateter e explante durante in vivo C. albicans desenvolvimento de biofilme em um mouse. Além disso, exibimos a quantificação dos biofilmes maduros não só por classical UFC enumeração, mas também por BLI. Como mostrado na Figura 1A, não fosforescentes peças cateter de poliuretano foram cortadas em dispositivos 1 cm e subsequentemente revestidas com soro. Esta etapa é muito importante, po...

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Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.

Candida albicans biofilme Desenvolvimento on Foreign Bodies medicamente relevantes numa subcutânea modelo do rato Seguido por bioluminescência Imagem

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

candida-albicans-biofilm-development-on-medically-relevant-foreign

Research

JoVE Journal

Medicine

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

12.9K visualizações.  Institute of Botany and Microbiology, VIB, KU Leuven. We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.

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Monitoring Tumor Metastases and Osteolytic Lesions with Bioluminescence and Micro CT Imaging

Following intracardiac delivery of MDA-MB-231-luc-D3H2LN cells to Nu/Nu mice, systemic metastases developed in the injected animals. Bioluminescence imaging using IVIS Spectrum was employed to monitor the distribution and development of the tumor cells following the delivery procedure including DLIT reconstruction to measure the tumor signal and its location.
Development of metastatic lesions to the bone tissues triggers osteolytic activity and lesions to tibia and femur were evaluated longitudinally using micro CT. Imaging was performed using a Quantum FX micro CT system with fast imaging and low X-ray dose. The low radiation dose allows multiple imaging sessions to be performed with a cumulative X-ray dosage far below LD50. A mouse imaging shuttle device was used to sequentially image the mice with both IVIS Spectrum and Quantum FX achieving accurate animal positioning in both the bioluminescence and CT images. The optical and CT data sets were co-registered in 3-dimentions using the Living Image 4.1 software. This multi-mode approach allows close monitoring of tumor growth and development simultaneously with osteolytic activity.

An experimental mouse model of bone metastasis was established following intracardiac delivery of luciferase expressing mammary tumor cells. Tumor development and resulted osteolytic lesion were monitored longitudinally with bioluminescence and micro CT imaging.

Monitoramento metástases tumorais e lesões osteolíticas com bioluminescência e CT Micro Imagem

Following intracardiac delivery of MDA-MB-231-luc-D3H2LN cells to Nu/Nu mice, systemic metastases developed in the injected animals. Bioluminescence ...

Medicina

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotão imagem de invasão das células tumorais em um modelo de camundongo ortotópico de carcinoma epidermóide oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

Na imagem de bioluminescência vivo Tumor de mama Dynamics Hipóxia metástase do cancro cerebral em um modelo de rato

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Ultrasound Imaging-guided Intracardiac Injection to Develop a Mouse Model of Breast Cancer Brain Metastases Followed by Longitudinal MRI

Breast cancer brain metastasis, occurring in 30% of breast cancer patients at stage IV, is associated with high mortality. The median survival is only 6 months. It is critical to have suitable animal models to mimic the hemodynamic spread of the metastatic cells in the clinical scenario. Here, we are introducing the use of small animal ultrasound imaging to guide an accurate injection of brain tropical breast cancer cells into the left ventricle of athymic nude mice. Longitudinal MRI is used to assessing intracranial initiation and growth of brain metastases. Ultrasound-guided intracardiac injection ensures not only an accurate injection and hereby a higher successful rate but also significantly decreased mortality rate, as compared to our previous manual procedure. In vivo high resolution MRI allows the visualization of hyperintense multifocal lesions, as small as 310 &#181;m in diameter on T2-weighted images at 3 weeks post injection. Follow-up MRI reveals intracranial tumor growth and increased number of metastases that distribute throughout the whole brain.

A breast cancer brain metastasis mouse model is established with ultrasound imaging-guided intracardiac injection of MDA-MB231/Br-GFP cells. Development of multifocal intracranial metastases has been monitored longitudinally using high-resolution 9.4 T MRI.

Ecografia-guiada injeção intracardíaca para desenvolver um modelo do rato de mama metástases do cancro cerebral Seguido por Longitudinal MRI

Breast cancer brain metastasis, occurring in 30% of breast cancer patients at stage IV, is associated with high mortality. The median survival is only 6 ...

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no effective treatment for it yet. Limitations of currently used animal models impede understanding of the pathology mechanism. Multiphoton microscopy allows studying cells and tissues within intact animal brains longitudinally under physiological and pathological conditions. Here, we describe two models of acute brain injury studied by means of two-photon imaging of brain cell behavior under posttraumatic conditions. A selected brain region is injured with a sharp needle to produce a trauma of a controlled width and depth in the brain parenchyma. Our method uses stereotaxic prick with a syringe needle, which can be combined with simultaneous drug application. We propose that this method can be used as an advanced tool to study cellular mechanisms of pathophysiological consequences of acute trauma in mammalian brain in vivo. In this video, we combine acute brain injury with two preparations: cranial window and skull thinning. We also discuss advantages and limitations of both preparations for multisession imaging of brain regeneration after trauma.

Acute brain trauma is a severe injury that has no adequate treatment to date. Multiphoton microscopy allows studying longitudinally the process of acute brain trauma development and probing therapeutical strategies in rodents. Two models of acute brain trauma studied with in vivo two-photon imaging of brain are demonstrated in this protocol.

Aguda Cérebro Trauma em camundongos seguiu por Longitudinal dois fótons de imagem

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or subvert anti-tumor immune responses in order to survive and flourish. Tumors take advantage of a number of different mechanisms of immune &#8220;escape,&#8221; including the recruitment of tolerogenic DC, immunosuppressive regulatory T cells (Tregs), and myeloid-derived suppressor cells (MDSC) that inhibit cytotoxic anti-tumor responses. Conversely, anti-tumor effector immune cells can slow the growth and expansion of malignancies: immunostimulatory dendritic cells, natural killer cells which harbor innate anti-tumor immunity, and cytotoxic T cells all can participate in tumor suppression. The balance between pro- and anti-tumor leukocytes ultimately determines the behavior and fate of transformed cells; a multitude of human clinical studies have borne this out. Thus, detailed analysis of leukocyte subsets within the tumor microenvironment has become increasingly important. Here, we describe a method for analyzing infiltrating leukocyte subsets present in the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Mouse B16 melanoma tumor cells were inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice. At a specified time, tumors and surrounding skin were resected en bloc and processed into single cell suspensions, which were then stained for multi-color flow cytometry. Using a variety of leukocyte subset markers, we were able to compare the relative percentages of infiltrating leukocyte subsets between control and chemerin-expressing tumors. Investigators may use such a tool to study the immune presence in the tumor microenvironment and when combined with traditional caliper size measurements of tumor growth, will potentially allow them to elucidate the impact of changes in immune composition on tumor growth. Such a technique can be applied to any tumor model in which the tumor and its microenvironment can be resected and processed.

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

Avaliação do tumor infiltrantes Leucócitos Subconjuntos em um modelo de tumor subcutâneo

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and histopathologic features of the human disease. When GL261 cells are implanted intracranially in syngeneic C57BL/6 mice, the model has the added advantage of maintaining an intact immune microenvironment. Stable expression of luciferase in GL261 cells allows non-invasive cost effective bioluminescence monitoring of intracranial tumor growth. We have recently demonstrated that luciferase expression in GL261 cells does not affect the tumor growth properties, tumor cell immunomodulatory cytokine expression, infiltration of immune cells into the tumor, or overall survival of animals bearing the intracranial tumor. Therefore, it appears that the GL261 luciferase glioma model can be useful in the study of novel chemotherapeutic and immunotherapeutic modalities. Here we report the technique for generating stable luciferase expression in GL261 cells and how to study the in vitro and in vivo growth of the tumor cells by bioluminescence imaging.

GL261 glioma cells provide a useful immunocompetent animal model of glioblastoma. The goals of this protocol are to demonstrate proper techniques for monitoring intracranial tumor growth using in vivo bioluminescence imaging, and to verify the utility of luciferase-modified GL261 cells for studying tumor immunology and immunotherapeutic approaches for treating glioblastoma.

Bioluminescência imagem de um modelo animal para imunocompetentes Glioblastoma

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

A Neonatal do rato Spinal Cord Injury Compression Modelo

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

Visualização Quantitativa de Infiltrado de Leucócitos em um Modelo Murino de Miocardite Fulminante por Microscopia de Folha de Luz

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medição de contratilidade isométrica da artéria mesentérica Mouse usando fio miografia

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...