Nosso protocolo ajuda os investigadores a implementar dutos experimentais padronizados para realizar caracterização fenotípica de populações semelhantes por manchas imunofluorescentes. Com essa técnica, os pesquisadores podem analisar rigorosamente a composição semelhante de tecidos de doenças complexas e realizar análises qualitativas e quantitativas dos fenótipos dos tipos de interesse celular. Demonstrando o procedimento estará Sidney Mahan, um técnico do meu laboratório.
Para preparar o animal para a colheita da artéria braquiocefálica, corte o peritônio até o esterno, tomando cuidado para não danificar os tecidos abdominais. E faça dois cortes na linha do meio do tórax, tomando cuidado para não danificar o coração e os pulmões. Em seguida, corte o diafragma para expor parcialmente o coração.
Para profusir o camundongo, instale um sistema de profusão de gravidade de modo que a pressão do fluido de profusão seja equivalente à pressão arterial murina média para permitir uma profusão consistente e manutenção da morfologia do vaso. Em seguida, profuse o animal com cinco mililitros de PBS de temperatura ambiente, 10 mililitros de paraformaldeído de temperatura ambiente de 4%, e cinco mililitros adicionais de PBS de temperatura ambiente. Conecte uma agulha borboleta de 23 ou 25 bitolas ao sistema de profusão de gravidade, e execute PBS através da agulha para expulsar o ar dos tubos antes de inserir a agulha no ventrículo esquerdo.
Depois de fixar a agulha no lugar, use uma tesoura de íris para fazer uma incisão de menos de dois centímetros no átrio direito. Colher os tecidos de interesse em paraformaldeído fresco de 4%. Para expor a artéria braquiocefálica, use uma tesoura para fazer uma incisão pela linha média do esterno através do manúbrio e use fórceps para puxar ambos os lados da caixa torácica para abrir totalmente a cavidade torácica.
Em seguida, coloque o animal sob um microscópio dissecando para visualizar parcialmente as carótidas, e use pinças finas para puxar os músculos, tecido conjuntivo e gordura até que a carótida direita, artéria braquiocefálica, bifurcação subclávia e arco aórtico sejam limpos e isolados do tecido conjuntivo circundante e gordura. Em seguida, use fórceps para pegar a carótida direita abaixo de sua bifurcação e fazer um corte inicial acima dos fórceps. Ainda assim, segurando a carótida, faça um segundo corte através da artéria subclávia e faça os dois cortes finais através do arco aórtico em ambos os lados da artéria braquiocefálica.
Em seguida, colete quaisquer outros tecidos vasculares de interesse e coloque a artéria braquiocefálica e os outros tecidos em solução de paraformaldeído de 4% durante a noite à temperatura ambiente. Para coloração imunofluorescente da artéria braquiocefálica, use um microtómeo para obter seções de 10 micrômetros através da amostra de tecido incorporado à parafina até que possa ser confirmado pela microscopia leve que o arco aórtico foi seccionado e a artéria braquiocefálica é visível. Ajuste a orientação do bloco até que o tecido esteja completamente perpendicular à lâmina do microtome e obtenha três seções de espessura de 10 micrômetros da artéria braquiocefálica por lâmina de vidro, até que a bifurcação subclávia seja atingida.
Quando todas as seções tiverem sido coletadas, hidrate as amostras de tecido sob uma capa química com duas imersões de xileno de cinco minutos, seguidas por uma série de etanol de imersão de cinco minutos, como indicado, e duas imersões de água desionizadas de cinco minutos. Em seguida, incubar slides em solução de recuperação de antígeno, de acordo com os protocolos padrão, seguido de aquecimento em um micro-ondas por 20 minutos. Depois de uma hora esfriar à temperatura ambiente, use uma caneta hidrofóbica para cercar cada seção de tecido.
E bloqueie qualquer ligação não específica com tampão de bloqueio por uma hora à temperatura ambiente. No final da incubação, rotule as amostras de tecido durante a noite a quatro graus Celsius com o coquetel de anticorpos primário de interesse, ou anticorpos de controle IgG combinados. Na manhã seguinte, a lavagem desliza três vezes em PBS por cinco minutos por lavagem, seguida de uma incubação de uma hora no coquetel de anticorpos secundários conjugados fluorescência apropriado e DAPI para visualização do núcleo.
Em seguida, use o meio de montagem adequado para microscopia de fluorescência para montar tampas nos slides. Para imagens de microscopia confocal das seções de tecido rotulado, use seções manchadas com o controle IgG e anticorpos primários para definir a sensibilidade do detector, o poder do laser e deslocamento para cada canal individual. Em seguida, defina as posições superiores e inferiores para a aquisição da pilha z e determine a espessura e o número de pilhas a serem imagens.
Quando todas as imagens forem adquiridas, abra as imagens no ImageJ e abra o painel de ferramentas de canal e pseudocolora os diferentes canais de coloração. Mescle os canais de cores. Todos os canais devem ficar visíveis na mesma imagem.
Ligue e desligue os canais de cores individuais dentro do painel de ferramentas do canal e clique com o botão direito do mouse no ícone de contagem para selecionar a ferramenta de vários pontos. Clique duas vezes no ícone de contagem para abrir o painel de ferramentas de ponto e selecione o tipo e o tamanho dos itens usados para contar as células. Confira mostrar tudo e ligue o canal DAPI apenas no painel de ferramentas do canal.
Em seguida, selecione o canal zero e clique em núcleos individuais a serem marcados, percorrendo as pilhas z para contar todos os núcleos manchados dentro da região de interesse. O número de eventos de célula única quantificado será indicado abaixo no painel de ferramentas de ponto. Quando todos os núcleos tiverem sido marcados, ligue outro canal de coloração e selecione o canal de contador um para marcar as células nas quais há uma colocalização entre o DAPI e a coloração de anticorpos.
Para coloração citoplasmática, selecione células com coloração ao redor do núcleo em toda a profundidade do núcleo, verificando múltiplas pilhas de z conforme necessário. Os resultados podem então ser expressos como o número de células para o número total de células positivas DAPI, ou o número de células por área dentro da região de interesse. A coloração imunofluorescente com anticorpos voltados para marcadores fenotípicos, como demonstrado, permite que imagens de cada marcador individual e contraste de interferência diferencial sejam adquiridas para o delineamento de regiões de interesse para a contagem de células únicas.
A contagem de células únicas para determinar a abundância de diferentes populações derivadas de células musculares lisas pode então ser realizada usando ImageJ. Por exemplo, a análise de contagem de células únicas na região da tampa fibrosa dessas seções transversais representativas revelou diferenças notáveis na composição celular da área da tampa fibrosa entre camundongos tratados com anticorpo beta antiFAX-1 e camundongos tratados com um controle igG compatível com isótipo. De fato, a inibição do BETA-1 foi associada a uma diminuição das células musculares lisas YFP-positivas, e um aumento nas células galectina-3-positivas.
Além disso, observou-se uma diminuição no número de células musculares aórticas de YFP, o músculo liso atorótico alfa actin positivo. Considerando que o número relativo de linfagos YFP positivos derivados de células musculares lisos foi significativamente aumentado em ambos os locais da artéria braquiocefálica. Notavelmente, a inibição do BETA-1 não impactou o número total de células osteocondrogênicas dentro da lesão, ou a proporção de células condrogênicas derivadas de células musculares lisas ou derivadas de macrófagos.
Este protocolo foi projetado para melhorar o rigor e a reprodutibilidade na análise da lesão aterosclerótica, padronizando etapas-chave como coleta de tecidos, processamento e secção, bem como contagem de células únicas. Este protocolo pode ser usado para analisar leitos vasculares adicionais propensos a apresentar lesões ateroscleróticas, incluindo a aorta e a raiz aórtica.
