Este trabalho foi apoiado por studentships da Universidade de Edimburgo (NSK) e Carnegie Trust (LL; Henry esquema Dryerre) e financiamento da Fundação Britânica do Coração (PWFH, BRW, MJS; RG / 05/008; PG / 05/007; PG / 08/068/25461) e Wellcome Trust (JRS, BRW, MJS; 08.314 / Z / 07 / Z). Os autores agradecem ao apoio ao seu trabalho assegurados pelo Centro de BHF-financiado da excelência da pesquisa prêmio para o Centro de Ciência Cardiovascular. Os autores são particularmente grato para o conselho do professor Masataka Sata (Universidade de Tokushima) e Dr. Igor Chersehnev (em grupo Dr. Ernane Reis &#39;em Mount Sinai School of Medicine) sobre o estabelecimento dos modelos cirúrgicos de produção lesão neointimal. O vídeo produzido e disponibilizado pela Sata et al. (Http://plaza.umin.ac.jp/~msata/english.htm) foi particularmente útil.

1. Indução cirúrgica de neoíntima lesões na artéria femoral do rato <ol><li> Experiências com animais deve ser realizado em conformidade com os requisitos de ética nacionais e institucionais. Todos cirurgia deve ser realizada utilizando técnica asséptica. Indução da lesão neointimal é conseguido utilizando uma modificação da técnica descrita por Roque et al. 12 e Sata et ai. 13. </li><li> Pesar masculino C57BL6 / J ratinhos (Idade 10-12 semanas; peso de 25-30 g), em seguida, anestesiar entregando 4-5% de isoflurano em uma câmara de indução. Uma vez que a anestesia foi induzida, transferir o rato para uma esteira aquecida para manter a temperatura corporal a 37 ° C. Continuar a administração de isoflurano (2-3%) por meio de uma máscara. </li><li> Uma vez que um nível apropriado de anestesia foi induzida (falta de resposta aos pés pitada), proporcionar uma cobertura analgésico, por administração de buprenorfina (0,1 mg / kg-1). Em seguida, coloque o mouse em uma posição um supinod raspar a superfície ventral do membro posterior esquerdo. </li><li> Realizar uma incisão para expor a musculatura do membro posterior e superior, entre a bifurcação com a artéria popliteal e da parede abdominal, usar uma dissecção romba para isolar a artéria femoral e da veia femoral do nervo. Lavar a ferida como necessário usando 1% w / v de lidocaína. </li><li> Coloque proximal (perto da parede abdominal) e distal (imediatamente abaixo do ramo com a artéria poplítea) ligaduras temporários (6/0) Mersilk ao redor da artéria femoral e da veia para controlar o fluxo de sangue. Em seguida, isolar a artéria poplítea (aproximadamente 2-5 mm distal para o ramo com a artéria femoral) e ligar para distal. Coloque uma segunda ligadura, desatado por baixo da artéria poplítea. </li><li> Fazer uma pequena incisão (arteriotomia) na artéria popliteal, imediatamente distal ao ramo com a artéria femoral, evitando a hemorragia através da aplicação de pressão à ligadura temporária proximal. Avança uma linha reta, surgiram 0.014 &quot;fio-guia1-1,5 cm ao longo da artéria femoral na direcção da parede abdominal e deixar no lugar durante 30 segundos (Figura 1A). </li><li> Retirar o fio-guia e ligar a artéria poplítea acima da arteriotomia, usando a ligadura colocada para o efeito, e tomando cuidado para não obstruir a artéria femoral. NOTA: Para lesão induzida por ligadura. Remodelação sem lesão neointimal intraluminal pode ser induzida por ligação de as artérias femorais ou popliteal (Figura 1B e 1C). Para conseguir isso siga os passos de 1,1-1,5. No entanto, não cometa o arteriotomy mas (evitando passo 1.6) ou (i) ligar a artéria poplítea imediatamente distal à artéria femoral ou (ii) ligar a artéria femoral comum no ponto de ramificação com a artéria poplítea. Em seguida, prossiga com o passo 1.8. </li><li> Remover ligaduras temporários, fechar a ferida com uma sutura externa descontínua (5/0 Mersilk) e aplicar o creme EMLA (2,5% lidocaína, prilocaína 2,5%). Permitir que os animais re<html> ganhar consciência (normalmente 5-10 min) e garantir que eles estão se movendo livremente em torno de sua gaiola (ligeira claudicação pode ser evidente na perna afetada, mas isso deve resolver ao longo dos primeiros 2-3 dias após a cirurgia) antes de voltar para os quartos segurando. Os ratos não têm que ser alojados individualmente após a cirurgia. </li><li> Que os animais possam recuperar para até 3 meses. Pequenas lesões começam a aparecer ~ 7 dias após a lesão de arame e vai chegar a um tamanho máximo estável após ~ 21-28 dias. </li></ol> 2. A indução de lesões ateroscleróticas na apolipoproteína E - / - Mice <ol><li> Administrar dieta ocidental (0,2% de colesterol; Research Diets, EUA) para sexo masculino, 6 semanas de idade camundongos ApoE-null (criados em casa) durante 12 semanas. </li><li> As lesões ateroscleróticas são frequentemente visíveis na inspecção bruto do arco aórtico e seus ramos principais (Figura 2). </li></ol> 3. Analisar Arterial lesões usando Projeção Optical Tomography (OPT) nt &quot;&gt; NOTA: As imagens OPT de lesões em artérias femorais de murino e amostras do arco aórtico foram obtidos usando um tomógrafo projeção óptica. <ol><li> Eutanásia ratos por perfusão transcardíaca fixação e exsanguinação sob anestesia terminal (80 mg / Kg de pentobarbital de sódio), usando heparinizado (10 U / ml), salino tamponado com fosfato (PBS) seguido de 10% de formalina tamponada neutra. </li><li> Isolar artérias femorais ou o arco aórtico e seus principais ramos (artéria carótida esquerda, artéria subclávia esquerda, tronco braquiocefálico), conforme o caso, e remover o material peri-adventícia estranho. Pós-correcção em 10% de formalina tamponada S / N, antes de armazenamento em etanol a 70% até serem necessários. </li><li> Incorporar artérias em 1,5% baixo ponto de fusão agarose, pré-filtrada através de Whatman 113 V papel. Fixe cada amostra a um OPT montagem magnética com adesivo de cianoacrilato com o eixo da embarcação em linha com a do monte. Corte o excesso de agarose para uma forma cónica. Desidratar em metanol a 100% durante pelo menos 12 h. </li><li> Cvasos lear por imersão (durante 12-24 h) em uma mistura de álcool benzílico e benzoato de benzilo (1: 2 v / v). </li><li> Coloque amostras desmatadas em um tomógrafo calibrado. Defina a resolução de 1024 x 1024, e determinar uma ampliação ótica que permite que toda a área de interesse para ser visto. Volume de OPT isotrópico é o eixo z é reconstruída para a mesma resolução (isto é, 1,024 x 1,024 x 1,024), a dimensão do voxel ~ 200 uM. Isto pode representar uma sobre-estimativa de resolução, como não são susceptíveis de ser artefactos de reconstrução. Ajustar a posição da amostra de modo a rodar sobre o seu próprio eixo no centro do campo de vista no campo luminoso, o canal de transmissão. </li><li> No canal de emissão GFP1 filtro (filtro de excitação de 425 nm com 40 nm passa-banda, filtro de emissão: 475 nm passe longo), concentrar-se a amostra e ajustar o tempo de exposição para maximizar a gama dinâmica da imagem resultante (evitar o excesso de saturação). Digitalizar o navio em apenas o canal de emissão GFP1, com um passo de 0,9 ° de rotação. &lt;/ Li&gt; <li> Em conclusão, confirme qualidade de aquisição de dados usando o software DataViewer. Remover espécime do scanner. </li><li> Para permitir a análise histológica subsequente, local da amostra em 100% de metanol para&gt; 24 horas antes do processamento de cera de parafina como normal. </li></ol> 4. Imagem e Análise da Reconstrução Tomográfica re-construção por filtrada retro-projeção é realizada utilizando software NRecon ou similar. Reconstruções pode ser realizada sem vigilância, em lotes. <ol><li> Melhorar a qualidade de imagem, compensando desalinhamento e ajustar os níveis de intensidade de imagem. </li><li> Verifique a qualidade de reconstrução de imagem usando o software DataViewer. </li><li> Identificar a seção apropriada da amostra para análise. Mantenha este comprimento consistente entre navios se as dimensões da luz devem ser registados. </li><li> Definir o contorno das lesões por rastreio manualmente a borda adequada para 1 em cada 50 re-construídas secções transversais. </li><li> Verifique cada seção transversal intercaladas para garantir interpolações gerados por computador estão corretas. Ajustar manualmente a fronteira, quando necessário. </li><li> Definir o limite de nível de cinza de forma que apenas a lesão é selecionado e exportar os dados de medição. </li><li> Para cada verificação, definir uma região vertical de interesse contendo a lesão e traçar a fronteira entre a mídia e neointima (ie., A posição da lâmina elástica interna) para cada 50 th varredura-line. Interpolar fronteiras íntima / mídia para as linhas de varredura intercalados em software, e verificar e corrigir o ajuste quando necessário. Além disso segmento este definido o volume tridimensional a um limiar de intensidade manualmente definido para produzir um conjunto imagem binária em que pixels brancos representam neointima e pixels pretos representam luz patente. </li><li> Medidas tomadas incluem: volume total da lesão (volume de objeto), o volume luminal (total de volume - volume de objeto) ea distribuição de lesão e lúmen cross-seitaional área ao longo do comprimento axial do vaso estudado. </li></ol>

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The authors have no competing financial interest.

Análise 3-dimensional tem um grande potencial para a substituição ou adição às técnicas histológicas 2-dimensionais que ainda sustentam a maioria das investigações de formação de lesão arterial. Aqui OPT é mostrado em pequenas artérias murinos (com artérias femorais murinos provavelmente representam os navios mais pequenos que podem ser analisadas com sucesso utilizando esta técnica). É, no entanto, também se podem utilizar com artérias (e lesões) a partir de outras espécies, incluindo as pequenas e médias vasos humanos de tamanho; o nosso grupo tem utilizado com sucesso a técnica de análise lesões em aorta de coelho (Bezuidenhout et ai;. não publicado). OPT promete uma análise mais rápida e uma maior informação estrutural em comparação com a histologia tradicional e tem a vantagem de não prevenir a posterior análise da amostra utilizando técnicas tanto histológicos e imuno-histoquímico. As imagens produzidas utilizando OPT deu detalhes anatômicos, mostrando locais de formação de lesãoe o tamanho das lesões nestas áreas. As artérias utilizadas nestas investigações são, provavelmente, perto do limite de resolução para a técnica ea qualidade da imagem, portanto, é prejudicada a um certo grau por artefatos (provavelmente resultantes de desalinhamento rotação, compensação incompleta, reflexão / refração nos vértices de agarose e problemas de focagem) . Apesar disso, os detalhes necessários (isto é, camadas da parede do vaso) permanecem discernível e, por conseguinte, a técnica é extremamente útil para a quantificação de camadas individuais. Na verdade, as imagens pode ser quantificada de forma rápida e reprodutível para fornecer medições da lesão e do volume da luz em secções de placa de rolamento do navio, bem como áreas de secção transversal da lesão e da luz nos locais seleccionados na amostra. Grande (aorta) e médias (femoral, carótida, subclávia) artérias murino - os geralmente utilizados para a análise da formação da lesão aterosclerótica e neotintimal em ratos - foram com sucessoanalisados ​​usando este método. Na verdade, agora temos usado OPT para demonstrar o efeito de intervenções farmacológicas e manipulação genética em tamanho aterosclerótica e neointimal lesão. Por exemplo, o bloqueio do receptor da endotelina alterada enquanto que a formação da lesão da neointima eliminação selectiva do receptor da endotelina B a partir do endotélio vascular não 15. Em ratos propensos a aterosclerose, eliminação genética das enzimas 11β-HSD1 16 ou galectina 3 17 foram mostrados para reduzir o tamanho das lesões ateroscleróticas. Quantificação do volume de lesão é uma vantagem óbvia de OPT. Ele dá uma indicação mais informativo da carga total da lesão em uma artéria 4 do que é geralmente obtida com métodos histológicos. Analisando toda a lesão reduz o viés de seleção e erro que, inevitavelmente, ocorrer quando secções distintas de uma embarcação são escolhidos para análise. Produção de perfis longitudinais lesão é mais uma força de OPT, Enfatizada pela comparação das lesões induzidas por diferentes tipos de lesão 13,16 (Figura 5). Por exemplo, tanto a ligadura completa e fio-inserção induzida oclusão quase total próximo à bifurcação femero-poplítea. Lesão de arame, lesões no entanto, produzidos que se estendiam ao longo de todo o comprimento da secção digitalizada, enquanto as lesões induzidas por ligadura arterial diminuiu rapidamente em tamanho e desaparecem. Este padrão é consistente com o maior grau de lesão provocada pela inserção do fio de guia de angioplastia. Gerando resultados semelhantes usando cortes histológicos é caro, consome tempo e trabalho intensivo. As vantagens do OPT incluem a qualidade das imagens que produz e sua velocidade relativa e simplicidade (temos rotineiramente digitalizada 20 navios por dia). A qualidade de imagem é exibida superior, ou pelo menos comparável, a outros métodos para gerar imagens em 3 dimensões ex vivo (como ressonância magnética e tomografia microbiologia), yet OPT requer tempo de verificação mais curtos (tempo de integração para os nossos estudos foi tipicamente 1-2sec / imagem) e é menos caro. A preparação da amostra se estende ao longo de vários dias, mas requer pouco trabalho, os vasos pode ser preparada em lotes, e os dados podem ser adquiridos de uma sessão. Consequentemente, o rendimento é alto e não requer o uso prolongado do scanner. Importante, a natureza não-destrutiva de OPT significa que pode ser utilizado para identificar locais de interesse para análise imuno-histoquímica; reduzindo assim a quantidade de corte e coloração requerida. É possível que o desenvolvimento de ultra-sons de alta resolução irá proporcionar um método alternativo para a quantificação volumétrica de lesões em artérias deste tamanho, mas os autores não têm conhecimento de qualquer publicação que demonstram esta aplicação. Talvez surpreendentemente, a qualidade da imagem em OPT é inferior a técnicas microscópicas (que pode, naturalmente, só podem ser realizados em amostras mais pequenas). Refinamentos propostos para Reconstruçãon de dados pode resolver esta limitação, permitindo a melhoria futura da qualidade da imagem 19,20. Outra preocupação metodológica é que o processamento de tecidos altera características da amostra. Por exemplo, a natureza lipofílica do agente de limpeza, álcool benzílico / benzoato de benzilo (BABB), é susceptível de remover lípido de lesões ateroscleróticas, enquanto a desidratação antes podem causar encolhimento (apesar de, é claro, de desidratação e remoção de lípidos passos são também uma característica de a preparação da amostra para a incorporação em cera de parafina). BABB foi utilizado nesta investigação porque, em comparação com agentes de compensação hidrofílicos (por exemplo, glicerol 21) que faz com que somente pequenas alterações na morfologia. Existem várias possibilidades para um maior desenvolvimento e refinamento de OPT, nomeadamente em matéria de acompanhamento do arranjo 3-dimensional de células-chave e fatores envolvidos na remodelação arterial sinalização. A forte autofluorescência do tecido arterial, que é talvantagem n na geração de imagens anatómicas, não é extinta por métodos existentes de branqueamento 22 e pode restringir a utilização de sondas fluorescentes para avaliar padrões de RNA e proteína de distribuição. A utilização de sondas colorimétricos (por exemplo β-galactosidase) visualizadas por imagiologia de transmissão pode ultrapassar esta limitação. Para concluir, OPT tem um grande potencial para geração de imagens em 3 dimensões das lesões na íntima das artérias murino. Ela representa um avanço considerável sobre os métodos 2-dimensionais que são geralmente de trabalho intensivo e não representam efectivamente o volume total da lesão. OPT é relativamente rápido, conveniente e não-destrutivos. Novos desenvolvimentos em análise de imagem prometem aumentar ainda mais o poder e utilidade da técnica.

A formação de lesões arteriais é fundamental para a elevada morbidade e mortalidade associadas com uma doença cardiovascular. Formação da lesão é considerada para ser causada por uma resposta inflamatória sem restrições à lesão arterial 2. As lesões ateroscleróticas formam lentamente em resposta à lesão crônica da parede arterial enquanto lesões reestenóticas desenvolver-se rapidamente na sequência de avaria mecânica aguda (por exemplo, após implante de stent). Os mecanismos que contribuem para o desenvolvimento de lesões arteriais foram consideravelmente clarificada através da utilização de modelos animais apropriados, muitas vezes em combinação com manipulações genéticas relevantes 1. Análise do tamanho e composição lesão tem classicamente dependia fortemente do ex vivo, histologia 2-dimensional (embora esta está a mudar com o desenvolvimento de métodos melhorados para a in vivo e ex vivo de detecção e análise de lesões em animais pequenos &lt;sup&gt; 3). A análise histológica de lesões arteriais é trabalhoso, demorado e fornece informação limitada da estrutura 3-dimensional. Por exemplo, a carga da lesão é comumente avaliado por medição da área da secção transversal de uma lesão (ou em sítios seleccionados aleatoriamente ou no local da oclusão máxima). Isso fornece uma análise incompleta de carga global lesão. Todo-mount tecnologia de imagem 3-dimensional fornece uma possível solução para este problema, mas surpreendentemente poucas possibilidades de utilização têm sido descritas. Isto pode ser devido principalmente ao tamanho das artérias do rato que são demasiado grandes para microscopia confocal de fotão único mas muito pequeno para imagiologia por ressonância magnética (MRI) 4 e de raios-X de tomografia computadorizada (TC) 5. Aplicação do ex vivo MRI e micro CT para o estudo de lesões ateroscleróticas em ratinhos sugerem que eles oferecem uma resolução limitada, mesmo em relativamente grandes artérias. Adicionado a isto, os tempos relativamente longos de aquisição necessárialimitar o rendimento (e aumentar os custos de digitalização) 4,6. Desenvolvimento de novas modalidades de imagem óptico (como tomografia de coerência óptica 3,7 e foto-acústica tomografia 8) oferece muito potencial para melhorar a imagem das lesões nas artérias murino. Potencial semelhante é mostrado por tomografia de projecção óptica (OPT) a qual foi desenvolvida para permitir a análise de embriões de ratinho. OPT foi concebido para amostras da imagem que variam de 0,3-10 ~ 9 mm de diâmetro. Transmissão de imagem grava a opacidade de uma amostra semi-translúcido para a luz visível policromática e, pode ser utilizado para a identificação de estruturas anatómicas. Emissão de registos de imagem de emissão de luz em comprimentos de onda de excitação seguinte específicos de endógena (por exemplo, colagénio, elastina) e fluoróforos exógenas na amostra. Isto também pode fornecer informação anatómica (uma vez que diferentes componentes do tecido pode diferir no tipo e densidade de espécies autofluorescentespresente). Além disso, a distribuição da imunorreactividade ou expressão do gene pode ser determinada com a utilização de sondas fluorescentes adequados 10. Para qualquer um dos modos de imagem (transmissão ou emissão), a luz é focalizada em um dispositivo de carga acoplada para permitir a captura de imagem iterativo conforme a rotação da amostra (geralmente 400 imagens em incrementos de 0,9 °). Estes podem ser utilizados para o cálculo do volume por métodos de reconstrução tomográficos padrão (como filtrou-projecção traseira (usando um algoritmo de cone) ou reconstrução iterativo). Este vídeo demonstra a nossa nova aplicação de OPT para análise 3-dimensional rápida, quantificável e rentável de lesões ateroscleróticas e neointimais, como descrito anteriormente em Kirkby et al. 11. A técnica mostrou ser adequado para quantificar o tamanho da lesão em três modelos comumente utilizados: (i) da artéria femoral fio-de lesões; (Ii) ligação da artéria femoral, e (iii) a aterosclerose induzida pela dieta em apolipoprotein E deficiente (ApoE - / -) ratinhos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="691">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Name of Reagent/Material</td>
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		</tr>
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			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Operating Microscope</td>
			<td style="width:180px;">Zeiss, Germany</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;">OPMI Pico i</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Anaesthetic Machine</td>
			<td style="width:180px;">Vet Tech, UK</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Fluovac</td>
			<td style="width:180px;">Harvard Apparatus UK</td>
			<td style="width:137px;">340387</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Fluosorber</td>
			<td style="width:180px;">Harvard Apparatus UK</td>
			<td style="width:137px;">340415</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Bead Steriliser</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools, UK</td>
			<td style="width:137px;">1800-45</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Heated Mat</td>
			<td style="width:180px;">Fine Sceince Tools, UK</td>
			<td style="width:137px;">21061-10</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Balance</td>
			<td style="width:180px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:137px;">MS1602S</td>
			<td style="width:180px;">PB1502 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Sutures</td>
			<td style="width:180px;">Ethicon, UK</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:180px;">5/0 Mersilk</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Guidewire</td>
			<td style="width:180px;">Cook Inc, USA</td>
			<td style="width:137px;">C-PMS-251</td>
			<td style="width:180px;">0.014&#8221;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Suture Silk</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools, UK</td>
			<td style="width:137px;">18020-60</td>
			<td style="width:180px;">6/0 Mersilk</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="169" rowspan="6" style="height:169px;width:195px;">Surgical Tools</td>
			<td rowspan="6" style="width:180px;">Fine Science Tools, UK</td>
			<td style="width:137px;">14058-09</td>
			<td style="width:180px;">Toughcut Iris scissors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:137px;">15000-01</td>
			<td style="width:180px;">Cohan-Vannas Spring Scissors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:137px;">11251-35</td>
			<td style="width:180px;">Dumont #5/45 Forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:137px;">11370-31</td>
			<td style="width:180px;">Moria Iris Forceps</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:137px;">13008-12</td>
			<td style="width:180px;">Halsted-Mosquito Haemostat</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:137px;">18050-35</td>
			<td style="width:180px;">Bulldog clips</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Bioptonics 3001 Tomograph&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Bioptonics, UK</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Magnetic OPT Mount</td>
			<td style="width:180px;">Bioptonics, UK</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Computer</td>
			<td style="width:180px;">Dell Inc, UK</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:137px;">F117606</td>
			<td style="width:180px;">Minipuls 3</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">DataViewer software&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Skyscan, Belgium</td>
			<td style="width:137px;">v.1.4.4</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">NRecon software&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Skyscan, Belgium</td>
			<td style="width:137px;">v.1.6.8</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">CTan software</td>
			<td style="width:180px;">Skyscan, Belgium</td>
			<td style="width:137px;">v.1.12</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:180px;">Merial Animal Health Ltd, UK</td>
			<td style="width:137px;">AP/Drugs/220/96</td>
			<td style="width:180px;">100% Inhalation vapour, liquid</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Medical Oxygen</td>
			<td style="width:180px;">BOC Medical, UK</td>
			<td style="width:137px;">UN1072</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Vetergesic</td>
			<td style="width:180px;">Alstoe Animal Health Ltd, UK</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;">0.3mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">1% Lignocaine</td>
			<td style="width:180px;">Hamlen Pharmaceuticals, UK</td>
			<td style="width:137px;">LD1010</td>
			<td style="width:180px;">10ml ampoule</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">EMLA Cream</td>
			<td style="width:180px;">Astra Zeneca, UK</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Sodium Pentobarbital</td>
			<td style="width:180px;">Ceva Animal Health Ltd, UK</td>
			<td style="width:137px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Western Diet</td>
			<td style="width:180px;">Research Diets, USA</td>
			<td style="width:137px;">D12079B</td>
			<td style="width:180px;">0.2% cholesterol</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:180px;">Sigma UK</td>
			<td style="width:137px;">P4417</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Heparin (Mucous)</td>
			<td style="width:180px;">Leo Laboratories, UK</td>
			<td style="width:137px;">PL0043/003GR</td>
			<td style="width:180px;">25, 0000 Units</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:180px;">Sigma, UK</td>
			<td style="width:137px;">HT501128</td>
			<td style="width:180px;">10%</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:180px;">VWR BDH Prolabo, UK</td>
			<td style="width:137px;">20821.33</td>
			<td style="width:180px;">Absolute AnalaR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Agarose</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen, UK</td>
			<td style="width:137px;">16020050</td>
			<td style="width:180px;">Low melting point</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Filter Paper</td>
			<td style="width:180px;">GE Healthcare, UK</td>
			<td style="width:137px;">113v</td>
			<td style="width:180px;">Whatman</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td style="width:180px;">Henkel, UK</td>
			<td style="width:137px;">4304</td>
			<td style="width:180px;">Loctite</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Benzyl alcohol</td>
			<td style="width:180px;">Sigma, UK</td>
			<td style="width:137px;">B6630</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Benzyl benzoate</td>
			<td style="width:180px;">Sigma, UK</td>
			<td style="width:137px;">402834</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Methanol</td>
			<td style="width:180px;">VWR BDH Prolabo, UK</td>
			<td style="width:137px;">20856.296</td>
			<td style="width:180px;">100%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and 3-dimensional quantitation of arterial lesions in mice using optical projection tomography

A geração e análise de lesões vasculares em modelos animais adequados é uma pedra angular da investigação sobre as doenças cardiovasculares, gerando informações importantes sobre a patogênese da formação da lesão e da ação de novas terapias. A utilização de ratos propensos a aterosclerose, métodos cirúrgicos de indução da lesão, a modificação da dieta e melhorou dramaticamente a compreensão dos mecanismos que contribuem para o desenvolvimento da doença e o potencial de novos tratamentos. Classicamente, a análise de lesões é realizada ex vivo utilizando técnicas histológicas 2-dimensional. Este artigo descreve a aplicação de tomografia de projecção óptica (OPT) a quantificação 3-dimensional de lesões arteriais. Como esta técnica é não destrutivo, que pode ser usado como um adjuvante para análises histológicas e imuno-histoquímicas convencionais. Neointimais lesões foram induzidas por fio-inserção ou ligadura da arte femoral ratoery, enquanto as lesões ateroscleróticas foram gerados através da administração de uma dieta aterogénica para apoE deficientes. As lesões foram examinadas usando OPT imagem de emissão autofluorescent seguido por histológico complementares e análise imunohistoquímica. OPT lesões claramente distinguida da parede vascular subjacente. O tamanho da lesão foi calculada em secções 2-dimensionais por planimetria, que permite o cálculo do volume da lesão e área de secção transversal máxima. Os dados gerados usando OPT foram consistentes com as medições obtidas usando histologia, confirmando a precisão da técnica e o seu potencial como um complemento (em vez de alternativa) aos métodos tradicionais de análise. Este trabalho demonstra o potencial da OPT para a imagem latente lesões ateroscleróticas e neointimais. Ele fornece um rápido, muito necessária técnica ex vivo para a quantificação 3-dimensional rotina de remodelamento vascular.

Varrimento preliminar da saudáveis ​​(não lesionado) artérias femorais de murino (n = 5), demonstrou que a imagem de transmissão não fornecer imagens úteis. Isto era uma consequência das artérias compensados ​​ficarem demasiado transparente (ao invés de também opaco) para imaging.However transmissão, isso é benéfico para a imagiologia de emissão como não há nenhuma absorvância / espalhamento do sinal emitido. Em contraste, as artérias femorais autofluoresce fortemente no canal de emissão, com o maior sinal de excitação a seguinte 405-445 nm (consistente com um pico de excitação de 410 nm para a elastina 14). 2 fatias tridimensionais reconstruídos a partir dessas imagens distinguidas claramente a mídia do lúmen e adventícia e lúmen. Em artérias femorais murinos colhidas 28 dias após arame (n = 6) ou ligation- (n = 5) lesão induzida espessamento neointimal foi evidente em projecções de emissões não tomográficos (Figura 3A). Em reconstruídos 2-dimensfatias ional, lesões neointimais concêntricos poderia ser distinguido a partir do suporte por sua emissão mais fraca (Figura 3B e Figura S1). Imagens de emissão OPT de amostras inteiras de montagem do arco aórtico e seus principais ramos de camundongos aterosclerótica (n = 8) lesões identificadas com a distribuição anatômica antecipada (ie., Na pequena curvatura do arco aórtico, a artéria inominada, e as origens da carótida esquerda e artéria subclávia esquerda (Figura 4A). imagens transversais indicou que estes eram lesões tipicamente excêntricos e foram prontamente distinguidos dos meios de comunicação e lúmen (Figura 4B, as Figuras S2 e S3). Artérias de processamento para análise histológica seguinte OPT confirmou a natureza não-destrutiva de OPT, com cortes corados com sucesso usando histológico (Estados Unidos Trichrome, PicrOsirius vermelho) e imuno-histoquímica (α-SMA, Mac-2) técnicas (Figuras 3C e 4C). A medição do tamanho da lesão utilizando TPO demonstrou ser consistente com as medições obtidas usando análise de imagem de secções histológicas colhidas no mesmo artéria 11. Planimetricos medições de área de lesão obtidos por OPT e histologia correlacionada de perto por regressão linear para o arame (R 2 = 0,92) e induzida por ligadura (R 2 = 0,89) lesões neointimais e placas ateroscleróticas (R 2 = 0,85). Um benefício importante de OPT é a sua capacidade para permitir a análise a 3 dimensões. Através do desenvolvimento de quantificação volumétrica de lesões com esta técnica, nós fomos capazes de gravar volumes de lesão no arame (0,1100 ± 0,0091 milímetro 3; n = 6) e artérias femorais com lesão de ligação (0,0200 ± 0,0089 milímetro 3; n = 5) e também em artérias ateroscleróticas braquiocefálicas (0.180 ± 0,018 milímetros 3; n = 8). As medições foram altamente reprodutíveis (coeficiente de variação de 5,4%, 11,4% e 4,8%, respectivamente, n = 4) de todos os tipos de lesão. Lesões neointimal em vasos de feridas fios eram maiores (p &lt;0,0001) do que os produzidos por ligação, de acordo com o grau mais elevado de danos infligidos pelo antigo. Os dados gerados também pode ser expressa como perfis de lesão (Figura 5) e processado para avaliação dinâmica e qualitativa (ver figuras S1 - S3). Esta abordagem demonstrou claramente a extensão da formação da lesão, em resposta a diferentes procedimentos de ferimento e em destaque a distribuição desigual da formação da lesão em vasos lesionados. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50627/50627fig1.jpg" /> Figura 1: Os métodos para iniciar a formação da lesão na artéria femoral murino &amp; #.160, (A) inserção retrógrada de uma angioplastia fio guia no interior da artéria femoral, por meio de uma arteriotomia da artéria popliteal estimula a formação da lesão em resposta ao estiramento lesão e remoção do endotélio. O fluxo sanguíneo é restabelecida através da secção lesada do navio. (B) proliferação da neoíntima na ausência de estiramento intraluminal, desnudação ou interrupção do fluxo de sangue pode ser induzida por ligação quer a femoral ou da artéria popliteal imediatamente distai em relação à bifurcação da artéria femoral. (C) Um desnudando não resposta mais grave lesão / proliferação pode ser induzida através da ligação de ambas as artérias femorais e poplíteos através do ponto de ramificação da artéria femoral comum. Esta técnica também vai bloquear o fluxo de sangue na porção distai da artéria femoral. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50627/50627fig2.jpg" /> Figura 2:. Característica deposição do ateroma no arco da aorta do rato A aterosclerose propenso (Apolipopotein E ratinhos deficientes) alimentados com uma dieta ocidental níveis elevados de colesterol durante 12 semanas desenvolver um padrão característico de deposição lesão no arco aórtico e seus ramos principais. Como demonstrado, as lesões são visíveis (setas), por inspecção bruto sob um microscópio de dissecação, no arco aórtico, a artéria inominada, e no óstio da artéria carótida esquerda e a artéria subclávia esquerda. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50627/50627fig3.jpg" /> Figura 3:. A formação da lesão seguinte ligadura da artéria femoral esquerda (A) imagens de emissão de fluorescência não-tomográficos (invertido para aumentar a clareza - regiões escuras correspondem a emissão mais forte) permitir a identificação do espessamento da íntima (arrowhe vermelhoPublicidades). (B) regiões distintas vasculares e do lúmen podem ser distinguidos em reconstruções tomográficas. (C) A análise histológica (Estados Unidos trichrome) enfatiza a clara semelhança com imagens obtidas utilizando OPT. Barras de escala em (AC) estão a 200 mm. Adaptado de Kirkby et al. 11 barras de escala em (AC) são 200 m. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50627/50627fig4.jpg" /> Figura 4:. De imagem do ateroma no arco da aorta de ratos propensos a aterosclerose (A) de ateroma (setas vermelhas) é prontamente aparente em imagens não-tomográficos (invertido de modo que as regiões mais escuras indicam emissão mais forte, melhorando assim a clareza) do arco aórtico, em locais como previsto ateroma-bearing por inspeção sob microscopia de luz (veja a Figura 2). (B) Este padrão de distribuição é confirmada no cr tomográficaOSS-seções. (C) histológico (Estados Unidos trichrome) coloração demonstra uma estreita semelhança com cortes tomográficos, e imuno-histoquímica utilizando vários anticorpos diferentes enfatiza a natureza complementar de OPT com abordagens tradicionais para a análise da lesão. Barras de escala em (A-B) são um milímetro; A barra de escala em (C) é de 250 um. RSA, artéria subclávia direita; RCA, artéria carótida direita; LCA, artéria carótida esquerda; LSA, artéria subclávia esquerda; BCA, artéria inominada; AAo, aorta ascendente; Dão, aorta descendente. Adaptado de Kirkby et al. 11 <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50627/50627fig5.jpg" /> Figura 5: Análise de perfis de lesão e lúmen indica variando extensão da proliferação neointimal em resposta a diferentes métodos de lesão arterial tomografia projeção óptica permite lesão e lúmen atravessar measuremen seccionais.ts a ser registada em função distância ao longo da artéria femoral. Isto demonstra claramente que, em comparação com uma artéria não lesionado (A), a ligadura parcial (B) produz lesões pequenas, relativamente discretas, ao passo que a ligação total (C) produz oclusão completa no local de ligação, mas a lesão não se estende até ao longo da artéria . Lesão de arame intraluminal (D) produz uma lesão que tapa quase completamente a porção distai da amostra e se estende ao longo de todo o comprimento da secção da artéria digitalizada. Adaptado de Kirkby et al. 11 Figura S1. Animadas reconstrução de imagens transversais obtidos a partir de uma artéria femoral do rato após lesão ligadura. Este tipo de imagem animada é útil tanto para análise qualitativa e quantitativa. À medida que a animação se move do proximal às secções distais da artéria do desenvolvimento gradual de uma neoíntima oclusiva, discoernible do lúmen e da mídia, é facilmente perceptível. Ramos laterais podem ser facilmente identificado e não existe oclusão luminal evidente e remodelação para fora da artéria com o aumento no tamanho das lesões. A oclusão completa da embarcação ocorre uma vez que o local de ligação é alcançada. Adaptado de Kirkby et al. 11 .. Figura S2 reconstrução animadas de imagens transversais de um arco aórtico de um rato aterosclerose propensas A animação começa com secções transversais da ascendente (da esquerda - que aparece em primeiro lugar) e descendente (à direita) aorta. Pequenas lesões aparecem na aorta ascendente como as de verificação se move na direcção do arco aórtico. As imagens, em seguida, mover-se através do arco para mostrar os óstios fortemente lesionado do braquiocefálico (à esquerda), carótida esquerda (no meio) e subclávia esquerda (direita) artérias. Como a verificação se move distalmente ao longo desses ramos das lesões e reduzir gradualmente desaparecer, pela primeira vez no subcartéria Lavian, em seguida, na carótida e, finalmente, na artéria inominada. Curiosamente, a lesão nos movimentos artéria inominada para o divisor de fluxo como este navio se divide em artérias carótida direita e subclávia direita. Adaptado de Kirkby et al. 11 Figura S3. Animadas, imagem-rendido volume de um arco da aorta de um murganho propenso a aterosclerose. A tomografia de projecção óptica permite a geração de imagens 3-dimensionais, neste caso, demonstrando distribuição lesão no arco aórtico de um apolipoproteína E do rato deficiente. (A) ateroma está presente nos locais esperados (ao longo da artéria inominada, no óstio das artérias carótidas e subclávia esquerda e na curvatura menor do arco aórtico). (B) Segmentação e prestação de lesão (mostrado em vermelho) tendo secções transversais enfatiza a distribuição das placas quando sobreposta à imagem original.Adaptado de Kirkby et al. 11

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Generation and 3-Dimensional Quantitation of Arterial Lesions in Mice Using Optical Projection Tomography

Ex vivo analysis of arterial lesions from animal models of cardiovascular disease classically relies on histological and immunohistochemical techniques. These provide 2-dimensional measurements in 3-dimensional lesions. This manuscript describes the generation of arterial lesions for quantitative analysis in 3-dimensions using optical projection tomography.

Geração e quantificação 3-Dimensional de Arterial lesões em ratos por meio de tomografia óptica de Projeção

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

9.7K visualizações.  The Queen's Medical Research Institute. Ex vivo analysis of arterial lesions from animal models of cardiovascular disease classically relies on histological and immunohistochemical techniques. These provide 2-dimensional measurements in 3-dimensional lesions. This manuscript describes the generation of arterial lesions for quantitative analysis in 3-dimensions using optical projection tomography.

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Doppler Optical Coherence Tomography of Retinal Circulation

Noncontact retinal blood flow measurements are performed with a Fourier domain optical coherence tomography (OCT) system using a circumpapillary double circular scan (CDCS) that scans around the optic nerve head at 3.40 mm and 3.75 mm diameters. The double concentric circles are performed 6 times consecutively over 2 sec. The CDCS scan is saved with Doppler shift information from which flow can be calculated. The standard clinical protocol calls for 3 CDCS scans made with the OCT beam passing through the superonasal edge of the pupil and 3 CDCS scan through the inferonal pupil. This double-angle protocol ensures that acceptable Doppler angle is obtained on each retinal branch vessel in at least 1 scan. The CDCS scan data, a 3-dimensional volumetric OCT scan of the optic disc scan, and a color photograph of the optic disc are used together to obtain retinal blood flow measurement on an eye. We have developed a blood flow measurement software called "Doppler optical coherence tomography of retinal circulation" (DOCTORC). This semi-automated software is used to measure total retinal blood flow, vessel cross section area, and average blood velocity. The flow of each vessel is calculated from the Doppler shift in the vessel cross-sectional area and the Doppler angle between the vessel and the OCT beam. Total retinal blood flow measurement is summed from the veins around the optic disc. The results obtained at our Doppler OCT reading center showed good reproducibility between graders and methods (&lt;10%). Total retinal blood flow could be useful in the management of glaucoma, other retinal diseases, and retinal diseases. In glaucoma patients, OCT retinal blood flow measurement was highly correlated with visual field loss (R2&gt;0.57 with visual field pattern deviation). Doppler OCT is a new method to perform rapid, noncontact, and repeatable measurement of total retinal blood flow using widely available Fourier-domain OCT instrumentation. This new technology may improve the practicality of making these measurements in clinical studies and routine clinical practice.

Total retinal blood flow is measured by Doppler optical coherence tomography and semi-automated grading software.

Doppler Tomografia de Coerência Óptica de circulação retiniana

Noncontact retinal blood flow measurements are performed with a Fourier domain optical coherence tomography (OCT) system using a circumpapillary double ...

Medicina

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

Modelagem e imagem 3-Dimensional Invasion cela coletiva

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

In organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is indispensable for proper physiological function, and the formation and maintenance of these structures is a highly regulated process. The analysis of these complex, 3-dimensional structures has greatly depended on either 2-dimensional examination in section or on dye injection studies. These techniques, however, are not able to provide a complete and quantifiable representation of the ductal or vascular structures they are intended to elucidate. Alternatively, the nature of 3-dimensional plastic resin casts generates a permanent snapshot of the system and is a novel and widely useful technique for visualizing and quantifying 3-dimensional structures and networks.
A crucial advantage of the resin casting system is the ability to determine the intact and connected, or communicating, structure of a blood vessel or duct. The structure of vascular and ductal networks are crucial for organ function, and this technique has the potential to aid study of vascular and ductal networks in several ways. Resin casting may be used to analyze normal morphology and functional architecture of a luminal structure, identify developmental morphogenetic changes, and uncover morphological differences in tissue architecture between normal and disease states. Previous work has utilized resin casting to study, for example, architectural and functional defects within the mouse intrahepatic bile duct system that were not reflected in 2-dimensional analysis of the structure1,2, alterations in brain vasculature of a Alzheimer's disease mouse model3, portal vein abnormalities in portal hypertensive and cirrhotic mice4, developmental steps in rat lymphatic maturation between immature and adult lungs5, immediate microvascular changes in the rat liver, pancreas, and kidney in response in to chemical injury6.
Here we present a method of generating a 3-dimensional resin cast of a mouse vascular or ductal network, focusing specifically on the portal vein and intrahepatic bile duct. These casts can be visualized by clearing or macerating the tissue and can then be analyzed. This technique can be applied to virtually any vascular or ductal system and would be directly applicable to any study inquiring into the development, function, maintenance, or injury of a 3-dimensional ductal or vascular structure.

A method of visualizing and quantifying the 3-dimensional structure of mouse hepatic portal vein or intrahepatic bile duct is described. This resin cast technique can also be applied to other ductal or vascular systems and allows for in situ visualization or quantification of a system's intact communicating architecture.

3-Dimensional Fundição de resina e Imagem da Veia Rato Portal ou Sistema intra-hepática Duto Biliar

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of pancreatic tissue, such as the rat pancreas, and to increase the number of channels (cell types) that may be studied in a single specimen. We further describe the implementation of a number of computational tools that provide: 1/ accurate positioning of a specimen's (in our case the pancreas) centre of mass (COM) at the axis of rotation (AR)2; 2/ improved algorithms for post-alignment tuning which prevents geometric distortions during the tomographic reconstruction2 and 3/ a protocol for intensity equalization to increase signal to noise ratios in OPT-based BCM determinations3. In addition, we describe a sample holder that minimizes the risk for unintentional movements of the specimen during image acquisition. Together, these protocols enable assessments of BCM distribution and other features, to be performed throughout the volume of intact pancreata or other organs (e.g. in studies of islet transplantation), with a resolution down to the level of individual islets of Langerhans.

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &amp;#946;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

We describe the adaptation of optical projection tomography (OPT)1 to imaging in the near infrared spectrum, and the implementation of a number of computational tools. These protocols enable assessments of pancreatic &beta;-cell mass (BCM) in larger specimens, increase the multichannel capacity of the technique and increase the quality of OPT data.

Perto Tomografia Projeção óptico infravermelho para avaliações de β-célula distribuição em massa em Pesquisa do Diabetes

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of ...

In Vivo, Percutaneous, Needle Based, Optical Coherence Tomography of Renal Masses

Optical coherence tomography (OCT) is the optical equivalent of ultrasound imaging, based on the backscattering of near infrared light. OCT provides real time images with a 15 &#181;m axial resolution at an effective tissue penetration of 2-3 mm. Within the OCT images the loss of signal intensity per millimeter of tissue penetration, the attenuation coefficient, is calculated. The attenuation coefficient is a tissue specific property, providing a quantitative parameter for tissue differentiation. 
Until now, renal mass treatment decisions have been made primarily on the basis of MRI and CT imaging characteristics, age and comorbidity. However these parameters and diagnostic methods lack the finesse to truly detect the malignant potential of a renal mass. A successful core biopsy or fine needle aspiration provides objective tumor differentiation with both sensitivity and specificity in the range of 95-100%. However, a non-diagnostic rate of 10-20% overall, and even up to 30% in SRMs, is to be expected, delaying the diagnostic process due to the frequent necessity for additional biopsy procedures. 
We aim to develop OCT into an optical biopsy, providing real-time imaging combined with on-the-spot tumor differentiation. This publication provides a detailed step-by-step approach for percutaneous, needle based, OCT of renal masses.

In Vivo, Percutaneous, Needle Based, Optical Coherence Tomography of Renal Masses

Optical coherence tomography (OCT) is a high resolution imaging technique that allows analysis of tissue specific optical properties providing the means for tissue differentiation. We developed needle based OCT, providing real-time imaging combined with on-the-spot tumor differentiation. This publication describes a method for percutaneous, needle based OCT of renal masses.

Na Vivo, percutânea, Agulha Based, Tomografia de Coerência Óptica de massas renais

Optical coherence tomography (OCT) is the optical equivalent of ultrasound imaging, based on the backscattering of near infrared light. OCT provides real ...

Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the subretinal space, and to evaluate toxicity and efficacy in vivo. HR-SD-OCT uses near infrared light (800-880 nm) and has optics specifically designed for the unique optics of the mouse eye with sub-2-micron axial resolution. Transgenic mouse models of outer retinal (photoreceptor) degeneration and controls were imaged to assess the disease progression. Pulled glass microneedles were used to deliver sub retinal injections of adeno-associated virus (AAV) or nanoparticles (NP) via a trans-scleral and trans-choroidal approach. Careful positioning of the needle into the subretinal space was required prior to a calibrated pressure injection, which delivers fluid into the sub retinal space. Real time subretinal surgery was conducted on our retinal imaging system (RIS). HR-SD-OCT demonstrated progressive uniform retinal degeneration due to expression of a toxic mutant human mutant rhodopsin (P347S) (RHOP347S) transgene in mice. HR-SD-OCT allows rigorous quantification of all the retinal layers. Outer nuclear layer (ONL) thickness and photoreceptor outer segment length (OSL) measurements correlate with photoreceptor vitality, degeneration, or rescue. The RIS delivery system allows real-time visualization of subretinal injections in neonatal (~P10-14) or adult mice, and HR-SD-OCT immediately determines success of delivery and maps areal extent. HR-SD-OCT is a powerful tool that can evaluate the success of subretinal surgery in mice, in addition to measuring vitality of photoreceptors in vivo. HR-SD-OCT can also be used to identify uniform animal cohorts to evaluate the extent of retinal degeneration, toxicity, and therapeutic rescue in preclinical gene therapy research studies.

Here we demonstrate a novel approach to using high resolution spectral-domain optical coherence tomography (HR-SD-OCT) to assist delivery of gene therapy agents into the subretinal space, assess its areal coverage, and characterize photoreceptor vitality.

Tomografia de coerência óptica Mouse ultra alta resolução para auxiliar a injeção intra-ocular em pesquisa de terapia de genes da retina

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

Na Vivo Imagem de Cx3cr1gfp/gfp repórter ratos com a tomografia de coerência óptica espectral-domínio e digitalização Laser Oftalmoscopia

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Ablation of Ischemic Ventricular Tachycardia Using a Multipolar Catheter and 3-dimensional Mapping System for High-density Electro-anatomical Reconstruction

Ventricular tachycardia (VT) in patients with ischemic cardiomyopathy mainly results from endocardial scars after myocardial infarction; those scars represent zones of slow conduction that allow the occurrence and maintenance of reentrant circuits. Catheter ablation enables substrate modification of those low voltage areas and thus can help to alter the scar tissue in such a way that arrhythmias cannot appear anymore. Hospitalizations of concerned patients decrease, quality of life and outcome rise. Consequently, VT ablation represents a growing field in electrophysiology, especially for patients with endocardial scars in ischemic heart disease after myocardial infarction. However, ablation of ventricular tachycardia remains one of the most challenging procedures in the electrophysiology lab. Precise scar definition and localization of abnormal potentials are critical for ablation success. The following manuscript describes the use of a multipolar mapping catheter and 3-dimensional (3D) mapping system to create a high density electro-anatomical map of the left ventricle including a precise scar representation as well as mapping of fractionated and late potentials in order to allow a highly accurate substrate modification.

With the following protocol, we provide an approach to Ventricular Tachycardia (VT) ablation using high density mapping with a multipolar catheter and 3D mapping system enhancing the success of the procedure.

Ablação de taquicardia Ventricular isquêmica, usando um cateter Multipolar e sistema de mapeamento 3-dimensional para reconstrução de Electro-anatômica de alta densidade

Ventricular tachycardia (VT) in patients with ischemic cardiomyopathy mainly results from endocardial scars after myocardial infarction; those scars ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel interventions have remained elusive. This is likely due, in part, to a reliance on preclinical prevention models investigating the effects of genetic manipulations or pharmacological treatments on atherosclerosis development rather than the established disease. Also, results of these studies are often confounding because of the use of superficial lesion analyses and a lack of characterization of lesion cell populations. To help overcome these translational hurdles, we propose an increased reliance on intervention models that employ investigation of changes in cellular composition at a single cell level by immunofluorescent staining and confocal microscopy. To this end, we describe a protocol for testing a putative therapeutic agent in a murine intervention model including a systematic approach for animal dissection, embedding, sectioning, staining, and quantification of brachiocephalic artery lesions. In addition, due to the phenotypic diversity of cells within late-stage atherosclerotic lesions, we describe the importance of using cell-specific, inducible lineage tracing mouse systems and how this can be leveraged for unbiased characterization of atherosclerotic lesion cell populations. Together, these strategies may assist vascular biologists to more accurately model therapeutic interventions and analyze atherosclerotic disease and will hopefully translate into a higher rate of success in clinical trials.

We propose a standardized protocol to characterize the cellular composition of late-stage murine atherosclerotic lesions including systematic methods of animal dissection, tissue embedding, sectioning, staining, and analysis of brachiocephalic arteries from atheroprone smooth muscle cell lineage tracing mice.

Análise quantitativa da composição celular em lesões ateroscleróticas avançadas de ratos de rastreamento de linhagem celular músculo liso

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we present, in a step-by-step guide, the use of ElectroMap for analysis, quantification, and mapping of high-resolution voltage and calcium datasets acquired by optical mapping. ElectroMap analysis options cover a wide variety of key electrophysiological parameters, and the graphical user interface allows straightforward modification of pre-processing and parameter definitions, making ElectroMap applicable to a wide range of experimental models. We show how built-in pacing frequency detection and signal segmentation allows high-throughput analysis of entire experimental recordings, acute responses, and single beat-to-beat variability. Additionally, ElectroMap incorporates automated multi-beat averaging to improve signal quality of noisy datasets, and here we demonstrate how this feature can help elucidate electrophysiological changes that might otherwise go undetected when using single beat analysis. Custom modules are included within the software for detailed investigation of conduction, single file analysis, and alternans, as demonstrated here. This software platform can be used to enable and accelerate the processing, analysis, and mapping of complex cardiac electrophysiology.

This protocol describes the setup and use of ElectroMap, a MATLAB-based open-source software platform for analysis of cardiac optical mapping data. ElectroMap provides a versatile high-throughput tool for analysis of optical mapping voltage and calcium datasets across a wide range of cardiac experimental models.

Análise de alto throughput de dados de mapeamento óptico usando o ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...