Nós gostaríamos de agradecer a Facilidade FCCC Laboratory Animal por seu apoio neste projeto. Agradecemos Wolfe Laboratories, Inc. por sua assistência na análise dos níveis de paclitaxel no plasma e tecidos. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health concede K01CA120091 para EHB e CA06927 a Fox Chase Cancer Center.

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cancer Center, Animal Care Institucional e Uso do Fox Chase e pelo Biotério, e encontrado para estar em conformidade com as diretrizes institucionais para o tratamento humano dos animais. 1. Preliminar Preparação <ol><li> Preparação do cateter: Preparar um cateter a partir de um curto comprimento de tubagem de polietileno, modificado para formar um diluído, ponta furada (Figura 3A). Faça várias cateteres com antecedência e salvar indefinidamente. <ol><li> Acender um bico de Bunsen, e ajustar para estabelecer uma chama baixa constante. Segure tubulação perto de chama para amolecer polietileno. Quando a tubulação começa a derreter, lentamente puxe as duas pontas para criar uma seção engrossada da tubulação, aproximadamente 0,25 mm de diâmetro externo. </li><li> Corte uma extremidade chanfrada cerca de 0,75 centímetros ao longo seção fina. Isso garante tubulação suficiente para ser fixada na artéria, sem criar uma excessivamente longo cateter. NOTA: Um final longo e fino em the cateter tem uma propensão para entupir. Um excessivamente longo final também pode conter líquido suficiente para mudar significativamente a capacidade de volume de líquido do cateter. </li><li> Embotar a extremidade chanfrada, passando rapidamente através da chama - quando devidamente aquecido, o fim torna-se ligeiramente arredondada e ampliada. Os ganchos de ponta ligeiramente para trás, o que ajuda ancorar o tubo durante a inserção na artéria. </li><li> Corte os 6,0 centímetros tubulação a partir do ponto onde começa a fina. Isso faz com que um cateter muito manejável, que é longo o suficiente para enfiar até a saída do pescoço e para manter e trabalhar com confortavelmente, mas curto o suficiente para impedir que o mouse de roer excesso de tubulação ou exigindo muito volume de infusão extra para limpar salina inicial . </li><li> Prepare uma seringa de aproximadamente 0,2 ml de solução de heparina, coberto com uma agulha embotada. Inserir a agulha na extremidade larga do cateter (Figura 3B). Preencha cateter com heparina, tendo o cuidado de assegurar que não há bolhas ema tubagem. Coloque a seringa com heparina e cateter de lado em uma área estéril. Esterilizar cateteres por irradiação gama, através da colocação do cateter (s) numa placa de Petri, e expondo a 20 Gy de irradiação gama. Se você não tiver acesso a uma fonte de radiação gama, verifique com seu biotério para investigar outros meios de esterilização, tais como gás ou esterilização química. Não autoclave, como o polietileno não pode ser esterilizada pelo calor. </li></ol></li><li> Criação de um chumbo de solução salina (Figura 3B). <ol><li> Prepara-se uma segunda seringa de cerca de 0,5 ml de solução salina estéril, tendo o cuidado de garantir uma linha livre de bolhas. </li><li> Corte um segundo pedaço de tubo, de aproximadamente 15 centímetros, e deslizar para a agulha da seringa embotada. Anexar uma porta de conector para a extremidade livre do tubo. </li><li> Teste que o fluxo de solução salina é desobstruída por bem avançar um pequeno volume de solução salina através da liderança. Utilize este chumbo salina após a inserção do cateter, para verificar o fluxo atravéscateter, e para lavar a linha de sangue. Coloque a seringa salina de lado em uma área estéril. </li></ol></li><li> Antes da cirurgia, esterilizar o material em autoclave, ou, alternativamente, esterilização por gás ou esterilização de contas de vidro. </li><li> Prepare a área cirúrgica esterilizada. <ol><li> Limpe as superfícies de bancada e microscópio com desinfectante etanol como 70% ou dióxido de cloro. Cubra banco e base de microscópio com um pano limpo descartável, absorvente. </li><li> Prepare uma placa cirúrgica cobrindo com duas camadas de papel limpo, absorvente, bem presa com fita adesiva. </li></ol></li><li> Coloque para fora todos os materiais cirúrgicos (como catalogado na lista de materiais) para que sejam facilmente acessíveis. <ol><li> Corte três comprimentos de sutura estéril, 8 centímetros cada, e reserve com outros suprimentos. Coloque um porto onde será facilmente disponível (Figura 3B). </li></ol></li></ol> 2. Cirurgia <ol><li> Preparação do animal <ol><li> Anesthetize rato pela exposição a 2-3% de isoflurano em câmara de anestesia conectado a precisão vaporizador. Retirar rato da câmara, e raspar o cabelo do pescoço / torso superior do rato, e abaixo da orelha direita (local de saída do cateter). Administrar veterinária vaselina pomada oftálmica para os olhos para evitar a secura sob anestesia. Certifique-se de que o animal não despertar durante as preparações cirúrgicas por rato permitindo tempo suficiente na câmara de inalação antes de prep (pelo menos de dois minutos), ou através da administração de isoflurano para rato por meio de um cone de nariz durante a preparação. Retorno do mouse para câmara de anestesia. </li><li> Quando o rato é suficientemente inerte, mover para a área cirúrgica esterilizada, coloque anestesia cone do nariz sobre o nariz ea boca do mouse e desviar o fluxo de isoflurano para nariz cone. Confirme anesthetization adequada por beliscar a pata com uma pinça; quando o mouse não mostra nenhuma reação, prossiga para a próxima etapa. </li><li> Posicione o mouse sobre as suas costas, com a cabeça virada para ainvestigador. Prenda as orelhas, fore-patas traseiras e-patas para placa cirúrgica com fita adesiva ou outro dispositivo de retenção para manter o mouse estável. Limpe a área da incisão com iodopovidona e 70% de etanol. </li></ol></li><li> Isolamento da artéria carótida <ol><li> Faça um 1 centímetro longitudinal cortar um pouco para a direita da linha média do pescoço. Utilize uma pinça para separar o músculo e gordura para expor a traqueia (figura 4A). Localize a artéria carótida, paralela à da traquéia (Figura 4B). </li><li> Com cuidado, use uma pinça para fáscia separado que recobrem a artéria (Figura 4C). Levemente puxar o nervo vago além da carótida, e inserir uma pinça para dentro do espaço entre os dois. Fórceps gentilmente abertos para criar uma lacuna na fascia e, cuidadosamente, afastar o nervo da artéria, a partir da bifurcação da artéria perto da laringe (extremidade anterior), para cima (posterior) na medida do possível (pelo menos 3 mm) ( Figura 4D). </li><li> Limpar qualquer refáscia maining até a artéria é bem isolado (Figura 4E). Adicionar uma gota de salino para a área de cirurgia ocasionalmente para manter o tecido húmido e, assim, menos quebradiço e menos propensos a rasgar aleatoriamente. </li></ol></li><li> Colocação de sutura e preparação para a inserção do cateter de artéria (Figuras 4, 5). <ol><li> Use uma pinça para tirar um fio de sutura de seda sob a artéria. Dê um nó seguro para fechar a artéria tão longe em direção ao anterior quanto possível (Figura 4F). </li><li> Desenhe uma segunda linha sob a artéria. Dê um nó retrátil para fechar temporariamente a artéria tão longe em direção ao posterior possível (Figura 4F). </li><li> Desenhe uma terceira linha sob a artéria. Dê um nó muito solto entre os dois primeiros suturas, a ser usado para fixar rapidamente o cateter após a colocação (Figura 4G). </li><li> Mantenha todas as extremidades das suturas para fora do caminho molhando-os com um pouco de etanol a 70%. </li></ol></li><li&gt; inserção do cateter <ol><li> Com a sutura, pegue o nó mais baixo para puxar a artéria pouco tenso. Nick artéria acima, mas muito perto, a sutura anterior (Figura 4H). Tenha cuidado para não cortar muito profundamente, mas verifique a fenda para garantir que a abertura é desobstruída. </li><li> Remover cateter cheio de heparina de agulha de seringa, tentando evitar a criação de grandes bolsões de ar em cada extremidade. Manipular o cateter para a posição de bisel em um ângulo confortável, geralmente para baixo e ligeiramente para a direita (para destros). </li><li> Enquanto segurando a sutura para manter a artéria restante ligeiramente tenso, insira suavemente cateter na fenda (Figura 4I). Use a pinça para segurar a sutura anterior e puxe para baixo sobre a artéria cateter (empurrando para cima excessivamente com o cateter pode causar o fim chanfrado para perfurar a artéria). Cuidadosamente libertar o cateter e anterior sutura. </li></ol></li><li> Obtenção de cateter eo início do fluxo de sangue (Figuras 4J, 5B). <ol><li> Fixar o cateter, apertando o nó da sutura meio, perto da entrada do cateter na artéria. Faça um nó triplo apertado, mas não se esqueça de puxar tão apertada como a obstruir o fluxo através do cateter. Além disso fixar o cateter, amarrando-o para baixo com o fio de sutura anterior, a seguir à entrada da artéria. </li><li> Fixar a vantagem de solução salina para o cateter por meio do conector de ficha, novamente tentando evitar a introdução de bolhas de ar na linha. </li><li> Segure as extremidades da sutura posterior e puxe para liberar o nó. Manobra da sutura para baixo da artéria, em relação ao final do cateter (não remova o fio). O sangue deve fluir para o cateter; se não houver fluxo sanguíneo, mexer suavemente cateter para tentar remover a constrição. </li><li> Quando o fluxo parece desobstruída, use o último fio (da sutura posterior) para amarrar um nó adicional, ligeiramente acima da sutura médio. </li></ol></li><li> Temporary vedação de cateter. Lavar o cateter de sangue, em seguida, utilizar uma pinça hemostática para prender a extremidade do cateter perto do conector de ficha. Remover o conector e substituí-la com a ficha de porta para vedar a extremidade do cateter, e remover a pinça hemostática. </li><li> Reposicionamento cateter para sair da parte de trás do pescoço. <ol><li> Com pinças em cada lado, utilizar um par de pinças para segurar o cateter logo abaixo da sutura anterior, e com a outra, pressionar uma dobra para dentro do cateter por isso vai dobrar facilmente para o lado. Repita o procedimento para criar uma segunda dobra. Isto permite que a extremidade livre do cateter a ser puxado para a parte traseira da cabeça do rato, sem forçar a ponta do cateter para ligar lateralmente contra a parede da artéria. </li><li> Ligue o rato sobre o seu lado (esquerdo), mantendo-se o cone de nariz posicionada sobre a boca e nariz, e limpar a área da incisão com etanol a 70% e povidona-iodo. Adicione uma pequena incisão (aproximadamente 4 mm) abaixo e atrás da orelha direita. </li&gt; <li> Use uma pinça para segurar a aba aberta de pele, durante o trabalho da sonda romba oco sob a pele para criar um canal através do mordente, para a cavidade no pescoço. É aconselhável levar a sonda ao redor da glândula salivar, em vez de tentar ir entre a glândula e pele. Use uma pinça para liberar cuidadosamente um espaço para a sonda para sair. </li><li> Passe plugue porta / cateter através de sonda para sair no pescoço. Não puxe muito difícil; certifique-se o cateter não está esmagando ou constrição dos vasos sanguíneos ou órgãos. </li></ol></li><li> Encerramento e recuperação. Administrar analgésico tópico (por exemplo, bupivacaína) à incisão no ombro, e cobrir a ferida com prova de água, fita adesiva cirúrgica. Aplicar um segundo pedaço de fita adesiva para proteger ainda mais o catéter. <ol><li> Administrar analgésico tópico para incisão no peito, e perto ferida com seda ou grampos. </li><li> Retire do mouse da anestesia, e permitir que animal a se recuperar em um ambiente limpo, aquecido espaço (lugar gaiola em cima de uma almofada de aquecimentoou sob uma lâmpada de aquecimento), durante pelo menos 30 min. </li></ol></li></ol> 3. Infusão <ol><li> Preparar alíquotas de 5 mg / ml, solução de paclitaxel / metanol. <ol><li> Medir 50 mg de paclitaxel para um tubo de centrífuga de 15 ml. Adicionar 10 ml de metanol estéril. Tubo Cap. Rodar à mão ou num agitador rotativo à temperatura ambiente até que o pó esteja dissolvido. </li><li> Alíquota de 500 ml de solução em 20 pequeno, congelador tubos de seguros, e armazenar a -20 ° C. </li><li> Aliquota indivíduo Descongelar à temperatura ambiente ou em banho de água a 37 ° C, imediatamente antes da infusão. </li></ol></li><li> Preparar a bomba de infusão (Figura 6). <ol><li> Corte um longo comprimento de tubo de polietileno de cerca de 40 cm. Anexar uma agulha embotada de uma extremidade, e uma porta de conector para o outro. </li><li> Desenha-se droga dentro de uma seringa com um diâmetro interno conhecido (a maioria das bombas programáveis ​​irá exigir que o diâmetro do cilindro da seringa, a fim de calcular a velocidade de the bomba de braço). Coloque a agulha da seringa e para carregar o medicamento através da agulha e da tubagem. </li><li> Situar a seringa na bomba de acordo com as instruções do fabricante. Primeiro a bomba para que a droga está fluindo sem problemas fora do conector, e ele está pronto para perfusão. </li></ol></li><li> Anexar mouse para bombear. <ol><li> Segure o mouse estável e usar a pinça hemostática para prender cateter, perto do plugue porta. Remova o plugue e substituir com o conector ligado à seringa e tubos. NOTA: O sangue pode começar a fluir de volta através de tubos. </li><li> Rapidamente administrar uma bomba rápida para limpar o volume do cateter (calculada através da observação empírica o volume de 6 cm de tubo), em seguida passar imediatamente para a razão de infusão desejada. </li></ol></li><li> Continue infusão Paclitaxel para o curso de tempo de três horas. <ol><li> Monitorar tubos ocasionalmente para verificar se há vazamentos nos cruzamentos como este é frequentemente um sinal de um bloqueio no fluxo para o mouse.Assista o mouse para reações esperadas ou inesperadas à infusão (letargia ou hiperatividade, sinais de desconforto). </li><li> Dependendo da duração e da natureza da infusão, o mouse pode não comer ou beber, mas não se esqueça de fornecer o acesso a alimentos e água de acordo com a política estabelecida da instituição. Esteja ciente do potencial para desidratar o mouse através da recolha de grandes quantidades de sangue. </li><li> Continue a manter o warm gaiola com uma almofada de aquecimento ou uma lâmpada, a não ser que o mouse aparece a vontade de ficar longe do calor. Se um animal não é sacrificado dentro de várias horas após a cirurgia, implementar plano de tratamento pós-cirúrgico do animal, incluindo as condições de habitação estéreis e tratamento para dor pós-cirúrgica. </li><li> Manter uma vigilância apertada sobre o mouse, especialmente no primeiro poucos minutos, para garantir que ele não puxe o tubo através hiperatividade, ou irritação da tubulação (que pode ser um sinal de uma inserção pobres). Se o mouse não está sobre-ativo, monito constanteanel pode não ser necessário, mas verifique o mouse rotineiramente para garantir que o animal não se emaranhar na tubulação. Arreios e sistema de corda estão disponíveis comercialmente, mas seu uso está fora do âmbito deste protocolo. </li></ol></li><li> Recolha de amostras. <ol><li> Coletar amostras de sangue em intervalos regulares por sangramentos submandibular ou retro-orbital (Se o seu protocolo não faz uso de modelos de tumores mamários, considere coleta de sangue através de um cateter jugular inserido, ao mesmo tempo que o cateter carótida). Tenha cuidado para não puxar a linha de infusão. Se a coleta por hemorragias retro-orbital, levemente anestesiar o mouse com um anestésico inalatório (por exemplo methoxyflurane) para que um não precisa agarrar pelo pescoço para garantir o mouse. </li><li> Girar o hematócrito no sangue em centrífuga para separar as células do sangue a partir do plasma. Use uma caneta arquivo ou diamante-ponta para marcar tubo em face de separação de fases. Quebre tubo e recolher plasma só, em, tubo congelador-safe pequeno. Guarde-o em -80 ° C até à análise. NOTA: Se uma centrífuga de hematócrito não está disponível, transferir a amostra de sangue em tubo de micro-centrífuga, e giram em uma micro-centrifugadora a alta velocidade para separar as células do sangue a partir do plasma. Recolher o plasma para um segundo tubo, e armazenar a -80 ° C. </li><li> Euthanize rato por asfixia com CO2. Colete tecido (cerca de 20-50 mg) de órgãos de interesse e congelamento de flash em nitrogênio líquido. Armazenar a -80 ° C até análise. </li></ol></li></ol> Análise 4. Amostra Observação: Todas as amostras para este protocolo foram analisados ​​através de um laboratório externo por cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC - MS / MS), que calculou as concentrações de paclitaxel como se segue: <ol><li> Extrair paclitaxel a partir de amostras. Homogeneizar amostra de tecido em ácido acético a 0,1%, 50% de metanol antes da extracção. Extrair o paclitaxel por extracção líquido / líquido, utilizando éter metil terc-butílico (MTBE) fortificado com um padrão analógico interno (docetaxel). Retirar amostras de MTBE e secos. Ressuspender em 50% de acetonitrilo, uma solução de ácido acético a 0,1%. </li><li> Prepare padrões de calibração. Adicionar uma concentração conhecida de paclitaxel a matriz de C57BL / 6 apropriar-se para se obter uma gama definitiva de normas (de 1 a 20.000 ng / ml para as amostras de plasma, a partir de 0,1 a 5.000 ng / mL para amostras de tecidos). Extrair as normas em duplicado, utilizando o mesmo método que para as amostras de estudo acima. Medir pico paclitaxel em amostras por HPLC / MS / MS utilizando ionização por electropulverização. </li><li> Calcular a concentração, utilizando o rácio de paclitaxel a área do padrão interno. Use padrões de calibração para criar uma curva padrão, e as amostras de estudo interpolados por encaixe na curva. Normalizar a concentração de amostras de estudo pelo peso inicial de amostra antes da homogeneização. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Infusão da artéria carótida é uma técnica importante neste estudo de farmacocinética de paclitaxel. Perfusão da artéria carótida é um método para distribuir rapidamente drogas em todo o sistema circulatório 14. A infusão hr 3 é um mímico mais perto de administração clínica de drogas, como taxanos do que injeções em bolus. A cirurgia pode ser realizada de forma fiável por um único indivíduo, o tempo de cirurgia é relativamente curto, e as taxas de sucesso são&gt; 75%. Após as amostras...

A infusão da droga através da carótida pode ser realizada de forma fiável e reprodutível pelo equipamento e técnica de optimização. O procedimento não é complicado, embora exija um bom controle e atenção aos detalhes. Superior cuidado e habilidade são necessários para isolar a artéria carótida e inserir o cateter, o qual pode, geralmente, ser adquirido através da prática. Cirurgia por um técnico experiente não deve exceder uma hora. Após a cirurgia bem sucedida, o rato deve aparecer normal e saudável (embora o rato pode reagir com a infusão da droga real), e fármaco (s) podem ser administrados em uma dosagem uniforme e contínua controlada. As amostras de sangue devem ser tomadas a partir de um site que não seja da artéria carótida; sangramentos retro-orbital provou fácil de coletar e satisfatória para análise das concentrações de drogas. Cateteres de tamanho e forma ideal são um trunfo inestimável para a execução de uma infusão de sucesso 11. Encontramos o cateteres disponíveis commercially muitas vezes a ser muito grande e / ou muito flexível para permitir um acesso conveniente para a artéria carótida do rato. Ele provou preferível cateteres de moda do tubo de polietileno usado para conectar o mouse para a infusão de seringa. Assim, todos os tubos, conectores e agulhas de dimensões eram consistentes, que simplificados conjunto de infusão. Usando esta técnica, não é necessário empurrar a ponta do cateter na artéria além do ponto onde ainda é visível, e o fluxo sanguíneo para a artéria carótida não é restaurado até depois de o cateter é inicialmente fixado. Isto reduz os riscos de punção da artéria ou de ter o cateter empurrado para fora pela alta pressão do fluxo sanguíneo. O projeto cateter aqui não incorpora uma &quot;colisão&quot; para segurá-la no lugar, garantindo assim o cateter bem com suturas e fita cirúrgica é uma prioridade. Infusões pode ser preferível para as injecções de bolus iv comuns, como um imitador de melhor administração clínica demedicamentos, tais como taxanos 3, 12, 13. A técnica aqui descrita foi desenvolvida originalmente para permitir a infusão em modelos de rato, em que o acesso à veia jugular ou femoral foi impedida por crescimento do tumor mamário e / ou vascularização excessiva da área de inserção. Este método pode muitas vezes ser adequado, mesmo em camundongos livres de tumor: apesar de isolar e cateterização da carótida é um pouco mais invasivo, descobrimos que é preferível a jugular, pois a propensão da parede jugular para rasgar resultou em inserções mais falhou e falhas para completar o curso de tempo de 3 horas. Embora os resultados aqui apresentados são de C57BL / 6J (in-educado casa) ratos, temos utilizado essa técnica para infundir com sucesso paclitaxel em várias linhagens de camundongos, incluindo FVB e mistos estirpes, a seguir a farmacocinética em modelos de ratos manipulados transgenicamente para regular as funções de transportadores celulares. As amostras de sangue e tecidos coletados mostraram níveis esperados de paclitaxel, no intervalo dos níveis observados após infusões jugulares 1. Esta técnica pode ser esperado funcionar igualmente bem em outros modelos de ratinho e com outras soluções injectáveis.

<table><tbody><tr><td>Polyethylene tubing 0.024&amp;rdquo; OD X 0.011&amp;rdquo; ID&amp;nbsp;</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>PE10</td><td></td></tr><tr><td>3 Blunted needles (30 gauge)</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>NB-30</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel port plug (28 gauge)</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>PP-28</td><td>Slightly larger than PE tubing ID, to fit snugly and keep a tight seal.</td></tr><tr><td>2 Stainless steel connector plugs (30 gauge)</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>C-30</td><td></td></tr><tr><td>Three 1 cc syringes</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 0.9% Saline solution</td><td>Hospira</td><td>0409-7984-37</td><td></td></tr><tr><td>Cath-Loc HGS Heparin/Glycerol Solution&amp;nbsp;</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>HGS</td><td></td></tr><tr><td>Silk suture</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>SUT-S&amp;nbsp;113</td><td></td></tr><tr><td>Vanna Scissors (micro-scissors)</td><td>World Precision Instruments</td><td>14122</td><td>This model has a curved tip, but straight-tip scissors work as well.</td></tr><tr><td>Hartman Mesquito Hemostatic Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501705</td><td></td></tr><tr><td>Betadine Swabsticks</td><td>Perdue Products L.P.</td><td>BSWS1S</td><td></td></tr><tr><td>Bupivacaine</td><td>Hospira</td><td>0409-1160-01</td><td>May be replaced with Lidocaine, or similar local anesthesia.</td></tr><tr><td>Paclitaxel</td><td>LC Laboratories</td><td>P-9600</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Hematocrit Capillary Tubes, Heparinized</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-566</td><td></td></tr><tr><td>Micro Capillary Tube Sealant&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-678</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J mice</td><td>Fox Chase Cancer Center, Laboratory Animal Facility in-house-bred</td><td></td><td></td></tr><tr><td>API 4000 Q-Trap mass spetrometer</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

carotid artery infusions for pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of taxanes in mice

Ao propor a utilização de um fármaco, a combinação de fármacos, ou a entrega de drogas para um novo sistema, deve-se avaliar a farmacocinética do fármaco no modelo de estudo. Como o uso de modelos do rato são muitas vezes um passo vital para a descoberta de drogas pré-clínica e no desenvolvimento de drogas 1-8, é necessária a concepção de um sistema para introduzir medicamentos em ratos de uma maneira reprodutível uniforme,. Idealmente, o sistema deve permitir a recolha de amostras de sangue em intervalos regulares ao longo de um período de tempo definido. A capacidade para medir as concentrações de droga por espectrometria de massa, tem permitido aos investigadores seguir as mudanças nos níveis de droga no plasma ao longo do tempo em murganhos individuais 1, 9, 10. Neste estudo, o paclitaxel foi introduzido em ratinhos transgénicos como uma infusão arterial contínua ao longo de três horas, enquanto que as amostras de sangue foram simultaneamente tomadas por hemorragias retro-orbital em momentos set. Infusões artéria carótida são uma alternativa potencial para as infusões de veia jugular, quando factores tais comotumores mamários ou outras obstruções fazer infusões jugular impraticável. Usando esta técnica, as concentrações de paclitaxel no plasma e tecido atingido níveis semelhantes em comparação com a infusão jugular. Neste tutorial, vamos demonstrar como a cateterização da artéria carótida com sucesso através da preparação de um cateter otimizado para o modelo individual do mouse, em seguida, mostrar como inserir e fixar o cateter na artéria carótida de rato, coloque a ponta do cateter para fora através da parte traseira do pescoço do rato, e ligar o rato a uma bomba para entregar uma velocidade controlada de influxo de drogas. Várias sangramentos retro-orbital de baixo volume para permitir a análise de concentrações de droga no plasma ao longo do tempo.

<html> O paclitaxel distribuição segue padrões previsíveis durante um regime de dosagem de 3 h de uma infusão de 15 minutos de alta velocidade, seguido de uma infusão de 165 minutos a baixa velocidade. A Figura 1 mostra uma comparação entre a infusão venosa concentrações de paclitaxel plasma jugular e da artéria carótida-infusões. As concentrações de paclitaxel cair rapidamente nos primeiros 15 minutos após a infusão inicial de alto volume, e depois se estab...

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Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Este método foi desenvolvido com o objectivo de proporcionar uma solução de fármaco estável através da artéria carótida, para avaliar a farmacocinética de drogas novas em modelos de rato.

Infusões artéria carótida para farmacocinéticas e farmacodinâmicas Análise de taxanos em Ratos

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

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22.9K visualizações.  Fox Chase Cancer Center.  Este método foi desenvolvido com o objectivo de proporcionar uma solução de fármaco estável através da artéria carótida, para avaliar a farmacocinética de drogas novas em modelos de rato. 

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A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified version of carotid partial ligation methods [1,2] to show that it acutely induces low and oscillatory flow conditions, two key characteristics of disturbed flow, in the mouse common carotid artery. Using this model, we have provided direct evidence that disturbed flow indeed leads to rapid and robust atherosclerosis development in Apolipoprotein E knockout mouse [3]. We also developed a method of endothelial RNA preparation with high purity from the mouse carotid intima [3]. Using this mouse model and method, we found that partial ligation causes endothelial dysfunction in a week, followed by robust and rapid atheroma formation in two weeks in a hyperlipidemic mouse model along with features of complex lesion formation such as intraplaque neovascularization by four weeks. This rapid in vivo model and the endothelial RNA preparation method could be used to determine molecular mechanisms underlying flow-dependent regulation of vascular biology and diseases. Also, it could be used to test various therapeutic interventions targeting endothelial dysfunction and atherosclerosis in considerably reduced study duration.

This describes a partial carotid ligation surgery, which causes disturbed flow conditions and subsequent atherosclerosis development (in two weeks) with intraplaque neo-vascularization (in four weeks) in the mouse common carotid artery. We also describe a novel method of RNA isolation from the carotid intima, providing high purity endothelial RNA.

Um modelo de Disturbed Aterosclerose Flow-induzido em rato artéria carótida pela ligadura parcial e um método simples de isolamento de RNA a partir do endotélio Carótidas

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

Medicina

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. Recently, impressive advances in novel therapies have dramatically prolonged survival and improved quality of life for many cancer patients. Sadly, incidence of brain metastatic recurrences is fast rising, and all current therapies are merely palliative. Hence, good experimental animal models are urgently needed to facilitate in-depth studies of the disease biology and to assess novel therapeutic regimens for preclinical evaluation. However, the standard in vivo metastasis assay via tail vein injection of cancer cells produces predominantly lung metastatic lesions; animals usually succumb to the lung tumor burden before any meaningful outgrowth of brain metastasis. Intracardiac injection of tumor cells produces metastatic lesions to multiple organ sites including the brain; however, the variability of tumor growth produced with this model is large, dampening its utility in evaluating therapeutic efficacy. To generate reliable and consistent animal models for brain metastasis study, here we describe a procedure for producing experimental brain metastasis in the house mouse (Mus musculus) via intracarotid injection of tumor cells. This approach allows one to produce large number of brain metastasis-bearing mice with similar growth and mortality characteristics, thus facilitating research efforts to study basic biological mechanisms and to assess novel therapeutic agents.

Brain metastasis has become an urgent unmet medical need as its incidence has increased while therapeutic options have remained palliative. Creating experimental animal models of brain metastasis via intracarotid arterial injection of cancer cells facilitates mechanistic studies of the disease biology and evaluation of novel intervention regimens.

Intracarotídeo injeção de células de cancer para produzir mouse modelos de metástases cerebrais

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Pesquisa do câncer

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce atherosclerosis (reviewed in 1 and 2). The role of shear stress has been extensively studied in vitro investigating the influence of flow dynamics on cultured endothelial cells 1,3,4 and in vivo in larger animals and humans 1,5,6,7,8. However, highly reproducible small animal models allowing systematic investigation of the influence of shear stress on plaque development are rare. Recently, Nam et al. 9 introduced a mouse model in which the ligation of branches of the carotid artery creates a region of low and oscillatory flow. Although this model causes endothelial dysfunction and rapid formation of atherosclerotic lesions in hyperlipidemic mice, it cannot be excluded that the observed inflammatory response is, at least in part, a consequence of endothelial and/or vessel damage due to ligation.
In order to avoid such limitations, a shear stress modifying cuff has been developed based upon calculated fluid dynamics, whose cone shaped inner lumen was selected to create defined regions of low, high and oscillatory shear stress within the common carotid artery 10. By applying this model in Apolipoprotein E (ApoE) knockout mice fed a high cholesterol western type diet, vascular lesions develop upstream and downstream from the cuff. Their phenotype is correlated with the regional flow dynamics 11 as confirmed by in vivo Magnetic Resonance Imaging (MRI) 12: Low and laminar shear stress upstream of the cuff causes the formation of extensive plaques of a more vulnerable phenotype, whereas oscillatory shear stress downstream of the cuff induces stable atherosclerotic lesions 11. In those regions of high shear stress and high laminar flow within the cuff, typically no atherosclerotic plaques are observed.
 
In conclusion, the shear stress-modifying cuff procedure is a reliable surgical approach to produce phenotypically different atherosclerotic lesions in ApoE-deficient mice.

The constricting cuff presented in this article is designed to induce atherosclerosis in the murine common carotid artery. Due to the conical shape of its inner lumen the implanted cuff generates well-defined regions of low, high and oscillatory shear stress triggering the development of atherosclerotic lesions of different inflammatory phenotypes.

Implantação de um Cuff Carotid para Triggering Shear-estresse aterosclerose induzida em camundongos

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural microenvironment and stromal cell interaction, cannot be entirely replicated with in vitro assays; thus, animal models are critical for investigating and understanding the effects of therapeutic intervention. However, most brain tumor xenografting methods do not produce brain metastases consistently in terms of the time frame and tumor burden. Brain metastasis models generated by intracardiac injection of cancer cells can result in unintended extracranial tumor burden and lead to non-brain metastatic morbidity and mortality. Although intracranial injection of cancer cells can limit extracranial tumor formation, it has several caveats, such as the injected cells frequently form a singular tumor mass at the injection site, high leptomeningeal involvement, and damage to brain vasculature during needle penetration. This protocol describes a mouse model of brain metastasis generated by internal carotid artery injection. This method produces intracranial tumors consistently without the involvement of other organs, enabling the evaluation of therapeutic agents for brain metastasis.

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Most brain metastasis mouse models are complicated by systemic metastases confounding analysis of mortality and therapeutic intervention outcomes. Presented here is a protocol for internal carotid injection of cancer cells that produces consistent intracranial tumors with minimal systemic tumors.

Modelagem de Metástases Cerebrais por Injeção de Células Cancerígenas na Artéria Carótida Interna

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Infusions in Mice

Pediatric CNS tumors are responsible for the majority of cancer-related deaths in children and have poor prognoses, despite advancements in chemotherapy and radiotherapy. As many tumors lack efficacious treatments, there is a crucial need to develop more promising therapeutic options, such as immunotherapies; the use of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy&#160;directed against CNS tumors is of particular interest. Cell surface targets such as B7-H3, IL13RA2, and the disialoganglioside GD2 are highly expressed on the surface of several pediatric and adult CNS tumors,&#160;raising the opportunity to use CAR T cell therapy against these and other surface targets. To evaluate the repeated locoregional delivery of CAR T cells in preclinical murine models, an indwelling catheter system that recapitulates indwelling catheters currently being used in human clinical trials was established. Unlike stereotactic delivery, the indwelling catheter system allows for repeated dosing without the use of multiple surgeries. This protocol describes the intratumoral placement of a fixed guide cannula that has been used to successfully test serial CAR T cell infusions in orthotopic murine models of pediatric brain tumors. Following orthotopic injection and engraftment of the tumor cells in mice, intratumoral placement of a fixed guide cannula is completed on a stereotactic apparatus and secured with screws and acrylic resin. Treatment cannulas are then inserted through the fixed guide cannula for repeated CAR T cell delivery. Stereotactic placement of the guide cannula can be adjusted to deliver CAR T cells directly into the lateral ventricle or other locations in the brain. This platform offers a reliable mechanism for the preclinical testing of repeated intracranial infusions of CAR T cells and other novel therapeutics for these devastating pediatric tumors.

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor CAR T Cell Infusions in Mice

Central nervous system (CNS) tumors are the leading cause of cancer-related death in children, and locoregional immune-based therapies are increasingly being tested for patients in clinical trials. This protocol describes methods for locoregional cannula implantation in mice for the preclinical evaluation of immunotherapeutic infusions targeting CNS tumors.

Implante de Cânula Intracraniana para Infusões Seriadas de Células T com Receptor de Antígeno Quimérico Quimérico (CAR) em Camundongos

Pediatric CNS tumors are responsible for the majority of cancer-related deaths in children and have poor prognoses, despite advancements in chemotherapy ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an increased risk of vascular morbidity.&#160;Yet, albeit&#160;the mounting clinical evidence, there is a paucity of clear studies of vascular toxicity and therefore the etiology of a heterogeneous group of vascular/cardiovascular disorders remains to be elucidated. Moreover, the mechanism that may underlie vascular toxicity can completely differ from the principles of chemotherapy-induced cardiotoxicity, which is related to direct myocyte injury. We have established a real-time, in vivo molecular imaging platform&#160;to evaluate&#160;the potential&#160;acute&#160;vascular toxicity of anti-cancer therapies.
We have set up a platform of in vivo, high-resolution molecular imaging&#160;in mice,&#160;suitable for visualizing vasculature within confined organs and reference blood vessels within the same individuals whereas each individual serve as its own control. Blood vessel walls were impaired after doxorubicin administration, representing a unique mechanism of vascular toxicity that may be the early event in end-organ injury. Herein, the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging is described, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

We herein describe the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

Induzida pela quimioterapia Vascular Toxicidade - em tempo real<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de Impairment Vessel

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

<meta charset="utf8"></head><body>Reparo da artéria carótida comum após injeção em um modelo de camundongo

Facilitating Repeat Intracarotid Injections in Mouse Models by a Novel Injection Site Repair Technique

Given recent advances in the delivery of novel antitumor therapeutics using endovascular selective intraarterial delivery methods in neuro-oncology, there is an urgent need to develop methods for intracarotid injections in mouse models, including methods to repair the carotid artery in mice after injection to allow for subsequent injections. We developed a method of intracarotid injection in a mouse model to deliver therapeutics into the internal carotid artery (ICA) with two alternative procedures. 
During injection, the needle is inserted into the common carotid artery (CCA) after tying a suture around the external carotid artery (ECA) and injected therapeutics are delivered into the ICA. Following injection, the common carotid artery (CCA) can be ligated, which limits the number of intracarotid injections to one. The alternative procedure described in this article includes a modification where intracarotid artery injection is followed by injection site repair of the CCA, which restores blood flow within the CCA and avoids the complication of cerebral ischemia seen in some mouse models. 
We also compared the delivery of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells (BM-hMSCs) to intracranial tumors when delivered through intracarotid injection with and without injection site repair following the injection. Delivery of BM-hMSCs does not differ significantly between the methods. Our results demonstrate that injection site repair of the CCA allows for repeat injections through the same artery and does not impair the delivery and distribution of injected material, thus providing a model with greater flexibility that more closely emulates intracarotid injection in humans.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Avançando no tratamento do glioblastoma por meio de estratégias de entrega intra-arterial para vírus oncolíticos e microRNAs

Repair of the intracarotid artery in a mouse model after injection returns blood flow to the artery without negatively impacting the distribution of the injected material. Injection site repair facilitates subsequent injections through the same artery and prevents cerebral ischemia in mouse strains that lack a complete Circle of Willis.

Facilitando injeções intracarotídeas repetidas em modelos de camundongos por uma nova técnica de reparo no local da injeção

Given recent advances in the delivery of novel antitumor therapeutics using endovascular selective intraarterial delivery methods in neuro-oncology, there ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

Técnica do mouse Microcirurgia de infusão para distribuição de substâncias alvejado no SNC<i&gt; via</i&gt; Artéria carótida interna

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

Infusões artéria carótida para farmacocinéticas e farmacodinâmicas Análise de taxanos em Ratos

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Um modelo de Disturbed Aterosclerose Flow-induzido em rato artéria carótida pela ligadura parcial e um método simples de isolamento de RNA a partir do endotélio Carótidas

Intracarotídeo injeção de células de cancer para produzir mouse modelos de metástases cerebrais

Implantação de um Cuff Carotid para Triggering Shear-estresse aterosclerose induzida em camundongos

Modelagem de Metástases Cerebrais por Injeção de Células Cancerígenas na Artéria Carótida Interna

Implante de Cânula Intracraniana para Infusões Seriadas de Células T com Receptor de Antígeno Quimérico Quimérico (CAR) em Camundongos

Induzida pela quimioterapia Vascular Toxicidade - em tempo real

Facilitando injeções intracarotídeas repetidas em modelos de camundongos por uma nova técnica de reparo no local da injeção

Facilitando injeções intracarotídeas repetidas em modelos de camundongos por uma nova técnica de reparo no local da injeção

Facilitando injeções intracarotídeas repetidas em modelos de camundongos por uma nova técnica de reparo no local da injeção

Técnica do mouse Microcirurgia de infusão para distribuição de substâncias alvejado no SNC