Nós gostaríamos de agradecer a Facilidade FCCC Laboratory Animal por seu apoio neste projeto. Agradecemos Wolfe Laboratories, Inc. por sua assistência na análise dos níveis de paclitaxel no plasma e tecidos. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health concede K01CA120091 para EHB e CA06927 a Fox Chase Cancer Center.

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cancer Center, Animal Care Institucional e Uso do Fox Chase e pelo Biotério, e encontrado para estar em conformidade com as diretrizes institucionais para o tratamento humano dos animais. 1. Preliminar Preparação <ol><li> Preparação do cateter: Preparar um cateter a partir de um curto comprimento de tubagem de polietileno, modificado para formar um diluído, ponta furada (Figura 3A). Faça várias cateteres com antecedência e salvar indefinidamente. <ol><li> Acender um bico de Bunsen, e ajustar para estabelecer uma chama baixa constante. Segure tubulação perto de chama para amolecer polietileno. Quando a tubulação começa a derreter, lentamente puxe as duas pontas para criar uma seção engrossada da tubulação, aproximadamente 0,25 mm de diâmetro externo. </li><li> Corte uma extremidade chanfrada cerca de 0,75 centímetros ao longo seção fina. Isso garante tubulação suficiente para ser fixada na artéria, sem criar uma excessivamente longo cateter. NOTA: Um final longo e fino em the cateter tem uma propensão para entupir. Um excessivamente longo final também pode conter líquido suficiente para mudar significativamente a capacidade de volume de líquido do cateter. </li><li> Embotar a extremidade chanfrada, passando rapidamente através da chama - quando devidamente aquecido, o fim torna-se ligeiramente arredondada e ampliada. Os ganchos de ponta ligeiramente para trás, o que ajuda ancorar o tubo durante a inserção na artéria. </li><li> Corte os 6,0 centímetros tubulação a partir do ponto onde começa a fina. Isso faz com que um cateter muito manejável, que é longo o suficiente para enfiar até a saída do pescoço e para manter e trabalhar com confortavelmente, mas curto o suficiente para impedir que o mouse de roer excesso de tubulação ou exigindo muito volume de infusão extra para limpar salina inicial . </li><li> Prepare uma seringa de aproximadamente 0,2 ml de solução de heparina, coberto com uma agulha embotada. Inserir a agulha na extremidade larga do cateter (Figura 3B). Preencha cateter com heparina, tendo o cuidado de assegurar que não há bolhas ema tubagem. Coloque a seringa com heparina e cateter de lado em uma área estéril. Esterilizar cateteres por irradiação gama, através da colocação do cateter (s) numa placa de Petri, e expondo a 20 Gy de irradiação gama. Se você não tiver acesso a uma fonte de radiação gama, verifique com seu biotério para investigar outros meios de esterilização, tais como gás ou esterilização química. Não autoclave, como o polietileno não pode ser esterilizada pelo calor. </li></ol></li><li> Criação de um chumbo de solução salina (Figura 3B). <ol><li> Prepara-se uma segunda seringa de cerca de 0,5 ml de solução salina estéril, tendo o cuidado de garantir uma linha livre de bolhas. </li><li> Corte um segundo pedaço de tubo, de aproximadamente 15 centímetros, e deslizar para a agulha da seringa embotada. Anexar uma porta de conector para a extremidade livre do tubo. </li><li> Teste que o fluxo de solução salina é desobstruída por bem avançar um pequeno volume de solução salina através da liderança. Utilize este chumbo salina após a inserção do cateter, para verificar o fluxo atravéscateter, e para lavar a linha de sangue. Coloque a seringa salina de lado em uma área estéril. </li></ol></li><li> Antes da cirurgia, esterilizar o material em autoclave, ou, alternativamente, esterilização por gás ou esterilização de contas de vidro. </li><li> Prepare a área cirúrgica esterilizada. <ol><li> Limpe as superfícies de bancada e microscópio com desinfectante etanol como 70% ou dióxido de cloro. Cubra banco e base de microscópio com um pano limpo descartável, absorvente. </li><li> Prepare uma placa cirúrgica cobrindo com duas camadas de papel limpo, absorvente, bem presa com fita adesiva. </li></ol></li><li> Coloque para fora todos os materiais cirúrgicos (como catalogado na lista de materiais) para que sejam facilmente acessíveis. <ol><li> Corte três comprimentos de sutura estéril, 8 centímetros cada, e reserve com outros suprimentos. Coloque um porto onde será facilmente disponível (Figura 3B). </li></ol></li></ol> 2. Cirurgia <ol><li> Preparação do animal <ol><li> Anesthetize rato pela exposição a 2-3% de isoflurano em câmara de anestesia conectado a precisão vaporizador. Retirar rato da câmara, e raspar o cabelo do pescoço / torso superior do rato, e abaixo da orelha direita (local de saída do cateter). Administrar veterinária vaselina pomada oftálmica para os olhos para evitar a secura sob anestesia. Certifique-se de que o animal não despertar durante as preparações cirúrgicas por rato permitindo tempo suficiente na câmara de inalação antes de prep (pelo menos de dois minutos), ou através da administração de isoflurano para rato por meio de um cone de nariz durante a preparação. Retorno do mouse para câmara de anestesia. </li><li> Quando o rato é suficientemente inerte, mover para a área cirúrgica esterilizada, coloque anestesia cone do nariz sobre o nariz ea boca do mouse e desviar o fluxo de isoflurano para nariz cone. Confirme anesthetization adequada por beliscar a pata com uma pinça; quando o mouse não mostra nenhuma reação, prossiga para a próxima etapa. </li><li> Posicione o mouse sobre as suas costas, com a cabeça virada para ainvestigador. Prenda as orelhas, fore-patas traseiras e-patas para placa cirúrgica com fita adesiva ou outro dispositivo de retenção para manter o mouse estável. Limpe a área da incisão com iodopovidona e 70% de etanol. </li></ol></li><li> Isolamento da artéria carótida <ol><li> Faça um 1 centímetro longitudinal cortar um pouco para a direita da linha média do pescoço. Utilize uma pinça para separar o músculo e gordura para expor a traqueia (figura 4A). Localize a artéria carótida, paralela à da traquéia (Figura 4B). </li><li> Com cuidado, use uma pinça para fáscia separado que recobrem a artéria (Figura 4C). Levemente puxar o nervo vago além da carótida, e inserir uma pinça para dentro do espaço entre os dois. Fórceps gentilmente abertos para criar uma lacuna na fascia e, cuidadosamente, afastar o nervo da artéria, a partir da bifurcação da artéria perto da laringe (extremidade anterior), para cima (posterior) na medida do possível (pelo menos 3 mm) ( Figura 4D). </li><li> Limpar qualquer refáscia maining até a artéria é bem isolado (Figura 4E). Adicionar uma gota de salino para a área de cirurgia ocasionalmente para manter o tecido húmido e, assim, menos quebradiço e menos propensos a rasgar aleatoriamente. </li></ol></li><li> Colocação de sutura e preparação para a inserção do cateter de artéria (Figuras 4, 5). <ol><li> Use uma pinça para tirar um fio de sutura de seda sob a artéria. Dê um nó seguro para fechar a artéria tão longe em direção ao anterior quanto possível (Figura 4F). </li><li> Desenhe uma segunda linha sob a artéria. Dê um nó retrátil para fechar temporariamente a artéria tão longe em direção ao posterior possível (Figura 4F). </li><li> Desenhe uma terceira linha sob a artéria. Dê um nó muito solto entre os dois primeiros suturas, a ser usado para fixar rapidamente o cateter após a colocação (Figura 4G). </li><li> Mantenha todas as extremidades das suturas para fora do caminho molhando-os com um pouco de etanol a 70%. </li></ol></li><li&gt; inserção do cateter <ol><li> Com a sutura, pegue o nó mais baixo para puxar a artéria pouco tenso. Nick artéria acima, mas muito perto, a sutura anterior (Figura 4H). Tenha cuidado para não cortar muito profundamente, mas verifique a fenda para garantir que a abertura é desobstruída. </li><li> Remover cateter cheio de heparina de agulha de seringa, tentando evitar a criação de grandes bolsões de ar em cada extremidade. Manipular o cateter para a posição de bisel em um ângulo confortável, geralmente para baixo e ligeiramente para a direita (para destros). </li><li> Enquanto segurando a sutura para manter a artéria restante ligeiramente tenso, insira suavemente cateter na fenda (Figura 4I). Use a pinça para segurar a sutura anterior e puxe para baixo sobre a artéria cateter (empurrando para cima excessivamente com o cateter pode causar o fim chanfrado para perfurar a artéria). Cuidadosamente libertar o cateter e anterior sutura. </li></ol></li><li> Obtenção de cateter eo início do fluxo de sangue (Figuras 4J, 5B). <ol><li> Fixar o cateter, apertando o nó da sutura meio, perto da entrada do cateter na artéria. Faça um nó triplo apertado, mas não se esqueça de puxar tão apertada como a obstruir o fluxo através do cateter. Além disso fixar o cateter, amarrando-o para baixo com o fio de sutura anterior, a seguir à entrada da artéria. </li><li> Fixar a vantagem de solução salina para o cateter por meio do conector de ficha, novamente tentando evitar a introdução de bolhas de ar na linha. </li><li> Segure as extremidades da sutura posterior e puxe para liberar o nó. Manobra da sutura para baixo da artéria, em relação ao final do cateter (não remova o fio). O sangue deve fluir para o cateter; se não houver fluxo sanguíneo, mexer suavemente cateter para tentar remover a constrição. </li><li> Quando o fluxo parece desobstruída, use o último fio (da sutura posterior) para amarrar um nó adicional, ligeiramente acima da sutura médio. </li></ol></li><li> Temporary vedação de cateter. Lavar o cateter de sangue, em seguida, utilizar uma pinça hemostática para prender a extremidade do cateter perto do conector de ficha. Remover o conector e substituí-la com a ficha de porta para vedar a extremidade do cateter, e remover a pinça hemostática. </li><li> Reposicionamento cateter para sair da parte de trás do pescoço. <ol><li> Com pinças em cada lado, utilizar um par de pinças para segurar o cateter logo abaixo da sutura anterior, e com a outra, pressionar uma dobra para dentro do cateter por isso vai dobrar facilmente para o lado. Repita o procedimento para criar uma segunda dobra. Isto permite que a extremidade livre do cateter a ser puxado para a parte traseira da cabeça do rato, sem forçar a ponta do cateter para ligar lateralmente contra a parede da artéria. </li><li> Ligue o rato sobre o seu lado (esquerdo), mantendo-se o cone de nariz posicionada sobre a boca e nariz, e limpar a área da incisão com etanol a 70% e povidona-iodo. Adicione uma pequena incisão (aproximadamente 4 mm) abaixo e atrás da orelha direita. </li&gt; <li> Use uma pinça para segurar a aba aberta de pele, durante o trabalho da sonda romba oco sob a pele para criar um canal através do mordente, para a cavidade no pescoço. É aconselhável levar a sonda ao redor da glândula salivar, em vez de tentar ir entre a glândula e pele. Use uma pinça para liberar cuidadosamente um espaço para a sonda para sair. </li><li> Passe plugue porta / cateter através de sonda para sair no pescoço. Não puxe muito difícil; certifique-se o cateter não está esmagando ou constrição dos vasos sanguíneos ou órgãos. </li></ol></li><li> Encerramento e recuperação. Administrar analgésico tópico (por exemplo, bupivacaína) à incisão no ombro, e cobrir a ferida com prova de água, fita adesiva cirúrgica. Aplicar um segundo pedaço de fita adesiva para proteger ainda mais o catéter. <ol><li> Administrar analgésico tópico para incisão no peito, e perto ferida com seda ou grampos. </li><li> Retire do mouse da anestesia, e permitir que animal a se recuperar em um ambiente limpo, aquecido espaço (lugar gaiola em cima de uma almofada de aquecimentoou sob uma lâmpada de aquecimento), durante pelo menos 30 min. </li></ol></li></ol> 3. Infusão <ol><li> Preparar alíquotas de 5 mg / ml, solução de paclitaxel / metanol. <ol><li> Medir 50 mg de paclitaxel para um tubo de centrífuga de 15 ml. Adicionar 10 ml de metanol estéril. Tubo Cap. Rodar à mão ou num agitador rotativo à temperatura ambiente até que o pó esteja dissolvido. </li><li> Alíquota de 500 ml de solução em 20 pequeno, congelador tubos de seguros, e armazenar a -20 ° C. </li><li> Aliquota indivíduo Descongelar à temperatura ambiente ou em banho de água a 37 ° C, imediatamente antes da infusão. </li></ol></li><li> Preparar a bomba de infusão (Figura 6). <ol><li> Corte um longo comprimento de tubo de polietileno de cerca de 40 cm. Anexar uma agulha embotada de uma extremidade, e uma porta de conector para o outro. </li><li> Desenha-se droga dentro de uma seringa com um diâmetro interno conhecido (a maioria das bombas programáveis ​​irá exigir que o diâmetro do cilindro da seringa, a fim de calcular a velocidade de the bomba de braço). Coloque a agulha da seringa e para carregar o medicamento através da agulha e da tubagem. </li><li> Situar a seringa na bomba de acordo com as instruções do fabricante. Primeiro a bomba para que a droga está fluindo sem problemas fora do conector, e ele está pronto para perfusão. </li></ol></li><li> Anexar mouse para bombear. <ol><li> Segure o mouse estável e usar a pinça hemostática para prender cateter, perto do plugue porta. Remova o plugue e substituir com o conector ligado à seringa e tubos. NOTA: O sangue pode começar a fluir de volta através de tubos. </li><li> Rapidamente administrar uma bomba rápida para limpar o volume do cateter (calculada através da observação empírica o volume de 6 cm de tubo), em seguida passar imediatamente para a razão de infusão desejada. </li></ol></li><li> Continue infusão Paclitaxel para o curso de tempo de três horas. <ol><li> Monitorar tubos ocasionalmente para verificar se há vazamentos nos cruzamentos como este é frequentemente um sinal de um bloqueio no fluxo para o mouse.Assista o mouse para reações esperadas ou inesperadas à infusão (letargia ou hiperatividade, sinais de desconforto). </li><li> Dependendo da duração e da natureza da infusão, o mouse pode não comer ou beber, mas não se esqueça de fornecer o acesso a alimentos e água de acordo com a política estabelecida da instituição. Esteja ciente do potencial para desidratar o mouse através da recolha de grandes quantidades de sangue. </li><li> Continue a manter o warm gaiola com uma almofada de aquecimento ou uma lâmpada, a não ser que o mouse aparece a vontade de ficar longe do calor. Se um animal não é sacrificado dentro de várias horas após a cirurgia, implementar plano de tratamento pós-cirúrgico do animal, incluindo as condições de habitação estéreis e tratamento para dor pós-cirúrgica. </li><li> Manter uma vigilância apertada sobre o mouse, especialmente no primeiro poucos minutos, para garantir que ele não puxe o tubo através hiperatividade, ou irritação da tubulação (que pode ser um sinal de uma inserção pobres). Se o mouse não está sobre-ativo, monito constanteanel pode não ser necessário, mas verifique o mouse rotineiramente para garantir que o animal não se emaranhar na tubulação. Arreios e sistema de corda estão disponíveis comercialmente, mas seu uso está fora do âmbito deste protocolo. </li></ol></li><li> Recolha de amostras. <ol><li> Coletar amostras de sangue em intervalos regulares por sangramentos submandibular ou retro-orbital (Se o seu protocolo não faz uso de modelos de tumores mamários, considere coleta de sangue através de um cateter jugular inserido, ao mesmo tempo que o cateter carótida). Tenha cuidado para não puxar a linha de infusão. Se a coleta por hemorragias retro-orbital, levemente anestesiar o mouse com um anestésico inalatório (por exemplo methoxyflurane) para que um não precisa agarrar pelo pescoço para garantir o mouse. </li><li> Girar o hematócrito no sangue em centrífuga para separar as células do sangue a partir do plasma. Use uma caneta arquivo ou diamante-ponta para marcar tubo em face de separação de fases. Quebre tubo e recolher plasma só, em, tubo congelador-safe pequeno. Guarde-o em -80 ° C até à análise. NOTA: Se uma centrífuga de hematócrito não está disponível, transferir a amostra de sangue em tubo de micro-centrífuga, e giram em uma micro-centrifugadora a alta velocidade para separar as células do sangue a partir do plasma. Recolher o plasma para um segundo tubo, e armazenar a -80 ° C. </li><li> Euthanize rato por asfixia com CO2. Colete tecido (cerca de 20-50 mg) de órgãos de interesse e congelamento de flash em nitrogênio líquido. Armazenar a -80 ° C até análise. </li></ol></li></ol> Análise 4. Amostra Observação: Todas as amostras para este protocolo foram analisados ​​através de um laboratório externo por cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC - MS / MS), que calculou as concentrações de paclitaxel como se segue: <ol><li> Extrair paclitaxel a partir de amostras. Homogeneizar amostra de tecido em ácido acético a 0,1%, 50% de metanol antes da extracção. Extrair o paclitaxel por extracção líquido / líquido, utilizando éter metil terc-butílico (MTBE) fortificado com um padrão analógico interno (docetaxel). Retirar amostras de MTBE e secos. Ressuspender em 50% de acetonitrilo, uma solução de ácido acético a 0,1%. </li><li> Prepare padrões de calibração. Adicionar uma concentração conhecida de paclitaxel a matriz de C57BL / 6 apropriar-se para se obter uma gama definitiva de normas (de 1 a 20.000 ng / ml para as amostras de plasma, a partir de 0,1 a 5.000 ng / mL para amostras de tecidos). Extrair as normas em duplicado, utilizando o mesmo método que para as amostras de estudo acima. Medir pico paclitaxel em amostras por HPLC / MS / MS utilizando ionização por electropulverização. </li><li> Calcular a concentração, utilizando o rácio de paclitaxel a área do padrão interno. Use padrões de calibração para criar uma curva padrão, e as amostras de estudo interpolados por encaixe na curva. Normalizar a concentração de amostras de estudo pelo peso inicial de amostra antes da homogeneização. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Infusão da artéria carótida é uma técnica importante neste estudo de farmacocinética de paclitaxel. Perfusão da artéria carótida é um método para distribuir rapidamente drogas em todo o sistema circulatório 14. A infusão hr 3 é um mímico mais perto de administração clínica de drogas, como taxanos do que injeções em bolus. A cirurgia pode ser realizada de forma fiável por um único indivíduo, o tempo de cirurgia é relativamente curto, e as taxas de sucesso são&gt; 75%. Após as amostras...

A infusão da droga através da carótida pode ser realizada de forma fiável e reprodutível pelo equipamento e técnica de optimização. O procedimento não é complicado, embora exija um bom controle e atenção aos detalhes. Superior cuidado e habilidade são necessários para isolar a artéria carótida e inserir o cateter, o qual pode, geralmente, ser adquirido através da prática. Cirurgia por um técnico experiente não deve exceder uma hora. Após a cirurgia bem sucedida, o rato deve aparecer normal e saudável (embora o rato pode reagir com a infusão da droga real), e fármaco (s) podem ser administrados em uma dosagem uniforme e contínua controlada. As amostras de sangue devem ser tomadas a partir de um site que não seja da artéria carótida; sangramentos retro-orbital provou fácil de coletar e satisfatória para análise das concentrações de drogas. Cateteres de tamanho e forma ideal são um trunfo inestimável para a execução de uma infusão de sucesso 11. Encontramos o cateteres disponíveis commercially muitas vezes a ser muito grande e / ou muito flexível para permitir um acesso conveniente para a artéria carótida do rato. Ele provou preferível cateteres de moda do tubo de polietileno usado para conectar o mouse para a infusão de seringa. Assim, todos os tubos, conectores e agulhas de dimensões eram consistentes, que simplificados conjunto de infusão. Usando esta técnica, não é necessário empurrar a ponta do cateter na artéria além do ponto onde ainda é visível, e o fluxo sanguíneo para a artéria carótida não é restaurado até depois de o cateter é inicialmente fixado. Isto reduz os riscos de punção da artéria ou de ter o cateter empurrado para fora pela alta pressão do fluxo sanguíneo. O projeto cateter aqui não incorpora uma &quot;colisão&quot; para segurá-la no lugar, garantindo assim o cateter bem com suturas e fita cirúrgica é uma prioridade. Infusões pode ser preferível para as injecções de bolus iv comuns, como um imitador de melhor administração clínica demedicamentos, tais como taxanos 3, 12, 13. A técnica aqui descrita foi desenvolvida originalmente para permitir a infusão em modelos de rato, em que o acesso à veia jugular ou femoral foi impedida por crescimento do tumor mamário e / ou vascularização excessiva da área de inserção. Este método pode muitas vezes ser adequado, mesmo em camundongos livres de tumor: apesar de isolar e cateterização da carótida é um pouco mais invasivo, descobrimos que é preferível a jugular, pois a propensão da parede jugular para rasgar resultou em inserções mais falhou e falhas para completar o curso de tempo de 3 horas. Embora os resultados aqui apresentados são de C57BL / 6J (in-educado casa) ratos, temos utilizado essa técnica para infundir com sucesso paclitaxel em várias linhagens de camundongos, incluindo FVB e mistos estirpes, a seguir a farmacocinética em modelos de ratos manipulados transgenicamente para regular as funções de transportadores celulares. As amostras de sangue e tecidos coletados mostraram níveis esperados de paclitaxel, no intervalo dos níveis observados após infusões jugulares 1. Esta técnica pode ser esperado funcionar igualmente bem em outros modelos de ratinho e com outras soluções injectáveis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="846">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:293px;">Table of specific reagents and equipment:</td>
			<td style="width:185px;">Source:</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:259px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Polyethylene tubing 0.024&#8221;OD X 0.011&#8221;ID&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:111px;">PE10</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Stainless steel port plug (30 gauge)</td>
			<td style="width:185px;">Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:111px;">NB-30</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">2 Stainless steel connector plugs (28 gauge)</td>
			<td style="width:185px;">Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:111px;">PP-28</td>
			<td style="width:259px;">Slightly larger than PE tubing ID, to fit snugly and keep a tight seal.</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">3 Blunted needles (30 gauge)</td>
			<td style="width:185px;">Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:111px;">C-30</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">3 1cc syringes</td>
			<td style="width:185px;">Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td style="width:111px;">309659</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Sterile 0.9% Saline solution</td>
			<td style="width:185px;">Hospira</td>
			<td style="width:111px;">0409-7984-37</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Cath-Loc HGS Heparin/Glycerol Solution&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:111px;">HGS</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Silk suture</td>
			<td style="width:185px;">Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:111px;">SUT-S&#160;113</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Vanna Scissors (micro-scissors)</td>
			<td style="width:185px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:111px;">14122</td>
			<td style="width:259px;">This model has a curved tip, but straight-tip scissors work as well.</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Hartman Mesquito Hemostatic Forceps</td>
			<td style="width:185px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:111px;">501705</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Betadine Swabsticks</td>
			<td style="width:185px;">Perdue Products L.P.</td>
			<td style="width:111px;">BSWS1S</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Bupivacaine</td>
			<td style="width:185px;">Hospira</td>
			<td style="width:111px;">0409-1160-01</td>
			<td style="width:259px;">May be replaced with Lidocaine, or similar local anesthesia.</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Paclitaxel</td>
			<td style="width:185px;">LC Laboratories</td>
			<td style="width:111px;">P-9600</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Methanol</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">32213</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Micro-Hematocrit Capillary Tubes, Heparinized</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">22-362-566</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">&#160;Capillary Tube Sealant&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">02-678</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">C57BL/6J mice</td>
			<td style="width:185px;">Fox Chase Cancer Center, Laboratory Animal Facility in-house-bred</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">API 4000 Q-Trap mass spetrometer</td>
			<td style="width:185px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

carotid artery infusions for pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of taxanes in mice

Ao propor a utilização de um fármaco, a combinação de fármacos, ou a entrega de drogas para um novo sistema, deve-se avaliar a farmacocinética do fármaco no modelo de estudo. Como o uso de modelos do rato são muitas vezes um passo vital para a descoberta de drogas pré-clínica e no desenvolvimento de drogas 1-8, é necessária a concepção de um sistema para introduzir medicamentos em ratos de uma maneira reprodutível uniforme,. Idealmente, o sistema deve permitir a recolha de amostras de sangue em intervalos regulares ao longo de um período de tempo definido. A capacidade para medir as concentrações de droga por espectrometria de massa, tem permitido aos investigadores seguir as mudanças nos níveis de droga no plasma ao longo do tempo em murganhos individuais 1, 9, 10. Neste estudo, o paclitaxel foi introduzido em ratinhos transgénicos como uma infusão arterial contínua ao longo de três horas, enquanto que as amostras de sangue foram simultaneamente tomadas por hemorragias retro-orbital em momentos set. Infusões artéria carótida são uma alternativa potencial para as infusões de veia jugular, quando factores tais comotumores mamários ou outras obstruções fazer infusões jugular impraticável. Usando esta técnica, as concentrações de paclitaxel no plasma e tecido atingido níveis semelhantes em comparação com a infusão jugular. Neste tutorial, vamos demonstrar como a cateterização da artéria carótida com sucesso através da preparação de um cateter otimizado para o modelo individual do mouse, em seguida, mostrar como inserir e fixar o cateter na artéria carótida de rato, coloque a ponta do cateter para fora através da parte traseira do pescoço do rato, e ligar o rato a uma bomba para entregar uma velocidade controlada de influxo de drogas. Várias sangramentos retro-orbital de baixo volume para permitir a análise de concentrações de droga no plasma ao longo do tempo.

<html> O paclitaxel distribuição segue padrões previsíveis durante um regime de dosagem de 3 h de uma infusão de 15 minutos de alta velocidade, seguido de uma infusão de 165 minutos a baixa velocidade. A Figura 1 mostra uma comparação entre a infusão venosa concentrações de paclitaxel plasma jugular e da artéria carótida-infusões. As concentrações de paclitaxel cair rapidamente nos primeiros 15 minutos após a infusão inicial de alto volume, e depois se estab...

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Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Este método foi desenvolvido com o objectivo de proporcionar uma solução de fármaco estável através da artéria carótida, para avaliar a farmacocinética de drogas novas em modelos de rato.

Infusões artéria carótida para farmacocinéticas e farmacodinâmicas Análise de taxanos em Ratos

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

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A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified version of carotid partial ligation methods [1,2] to show that it acutely induces low and oscillatory flow conditions, two key characteristics of disturbed flow, in the mouse common carotid artery. Using this model, we have provided direct evidence that disturbed flow indeed leads to rapid and robust atherosclerosis development in Apolipoprotein E knockout mouse [3]. We also developed a method of endothelial RNA preparation with high purity from the mouse carotid intima [3]. Using this mouse model and method, we found that partial ligation causes endothelial dysfunction in a week, followed by robust and rapid atheroma formation in two weeks in a hyperlipidemic mouse model along with features of complex lesion formation such as intraplaque neovascularization by four weeks. This rapid in vivo model and the endothelial RNA preparation method could be used to determine molecular mechanisms underlying flow-dependent regulation of vascular biology and diseases. Also, it could be used to test various therapeutic interventions targeting endothelial dysfunction and atherosclerosis in considerably reduced study duration.

This describes a partial carotid ligation surgery, which causes disturbed flow conditions and subsequent atherosclerosis development (in two weeks) with intraplaque neo-vascularization (in four weeks) in the mouse common carotid artery. We also describe a novel method of RNA isolation from the carotid intima, providing high purity endothelial RNA.

Um modelo de Disturbed Aterosclerose Flow-induzido em rato artéria carótida pela ligadura parcial e um método simples de isolamento de RNA a partir do endotélio Carótidas

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

Medicina

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are very limited. To meet the need for novel therapeutic approaches, experimental stroke research frequently employs rodent models of focal cerebral ischaemia. Most researchers use permanent or transient occlusion of the middle cerebral artery (MCA) in mice or rats.
Proximal occlusion of the middle cerebral artery (MCA) via the intraluminal suture technique (so called filament or suture model) is probably the most frequently used model in experimental stroke research. The intraluminal MCAO model offers the advantage of inducing reproducible transient or permanent ischaemia of the MCA territory in a relatively non-invasive manner. Intraluminal approaches interrupt the blood flow of the entire territory of this artery. Filament occlusion thus arrests flow proximal to the lenticulo-striate arteries, which supply the basal ganglia. Filament occlusion of the MCA results in reproducible lesions in the cortex and striatum and can be either permanent or transient. In contrast, models inducing distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA occlusion typically spare the striatum and primarily involve the neocortex. In addition these models do require craniectomy. In the model demonstrated in this article, a silicon coated filament is introduced into the common carotid artery and advanced along the internal carotid artery into the Circle of Willis, where it blocks the origin of the middle cerebral artery. In patients, occlusions of the middle cerebral artery are among the most common causes of ischaemic stroke. Since varying ischemic intervals can be chosen freely in this model depending on the time point of reperfusion, ischaemic lesions with varying degrees of severity can be produced. Reperfusion by removal of the occluding filament at least partially models the restoration of blood flow after spontaneous or therapeutic (tPA) lysis of a thromboembolic clot in humans.
In this video we will present the basic technique as well as the major pitfalls and confounders which may limit the predictive value of this model.

Filamentous occlusion of the Middle cerebral artery is a common model for studying ischemic stroke in mice.

Curso de modelagem em Ratos - Oclusão da Artéria Cerebral Média com o modelo de Filamento

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Modified Technique for Coronary Artery Ligation in Mice

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI we need better knowledge about pathophysiology of myocardial ischemia. This knowledge may be valuable to define new therapeutic targets for innovative cardiovascular therapies4. Experimental MI model in mice is an increasingly popular small-animal model in preclinical research in which MI is induced by means of permanent or temporary ligation of left coronary artery (LCA)5. In this video, we describe the step-by-step method of how to induce experimental MI in mice.
The animal is first anesthetized with 2% isoflurane. The unconscious mouse is then intubated and connected to a ventilator for artificial ventilation. The left chest is shaved and 1.5 cm incision along mid-axillary line is made in the skin. The left pectoralis major muscle is bluntly dissociated until the ribs are exposed. The muscle layers are pulled aside and fixed with an eyelid-retractor. After these preparations, left thoracotomy is performed between the third and fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The proximal segment of LCA artery is then ligated with a 7-0 ethilon suture which typically induces an infarct size ~40% of left ventricle. At the end, the chest is closed and the animals receive postoperative analgesia (Temgesic, 0.3 mg/50 ml, ip). The animals are kept in a warm cage until spontaneous recovery.

The surgical procedure used to induce experimental myocardial infarction in mice begins with left thoracotomy between the third and the fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The left coronary artery is ligated, the chest is closed and the mouse is allowed to recover spontaneously.

Técnica modificada para ligação da artéria coronária em ratos

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI ...

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce atherosclerosis (reviewed in 1 and 2). The role of shear stress has been extensively studied in vitro investigating the influence of flow dynamics on cultured endothelial cells 1,3,4 and in vivo in larger animals and humans 1,5,6,7,8. However, highly reproducible small animal models allowing systematic investigation of the influence of shear stress on plaque development are rare. Recently, Nam et al. 9 introduced a mouse model in which the ligation of branches of the carotid artery creates a region of low and oscillatory flow. Although this model causes endothelial dysfunction and rapid formation of atherosclerotic lesions in hyperlipidemic mice, it cannot be excluded that the observed inflammatory response is, at least in part, a consequence of endothelial and/or vessel damage due to ligation.
In order to avoid such limitations, a shear stress modifying cuff has been developed based upon calculated fluid dynamics, whose cone shaped inner lumen was selected to create defined regions of low, high and oscillatory shear stress within the common carotid artery 10. By applying this model in Apolipoprotein E (ApoE) knockout mice fed a high cholesterol western type diet, vascular lesions develop upstream and downstream from the cuff. Their phenotype is correlated with the regional flow dynamics 11 as confirmed by in vivo Magnetic Resonance Imaging (MRI) 12: Low and laminar shear stress upstream of the cuff causes the formation of extensive plaques of a more vulnerable phenotype, whereas oscillatory shear stress downstream of the cuff induces stable atherosclerotic lesions 11. In those regions of high shear stress and high laminar flow within the cuff, typically no atherosclerotic plaques are observed.
 
In conclusion, the shear stress-modifying cuff procedure is a reliable surgical approach to produce phenotypically different atherosclerotic lesions in ApoE-deficient mice.

The constricting cuff presented in this article is designed to induce atherosclerosis in the murine common carotid artery. Due to the conical shape of its inner lumen the implanted cuff generates well-defined regions of low, high and oscillatory shear stress triggering the development of atherosclerotic lesions of different inflammatory phenotypes.

Implantação de um Cuff Carotid para Triggering Shear-estresse aterosclerose induzida em camundongos

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Despite the considerable progress made in the stent development in the last decades, cardiovascular diseases remain the main cause of death in western countries. Beside the benefits offered by the development of different drug-eluting stents, the coronary revascularization bears also the life-threatening risks of in-stent thrombosis and restenosis. Research on new therapeutic strategies is impaired by the lack of appropriate methods to study stent implantation and restenosis processes. Here, we describe a rapid and accessible procedure of stent implantation in mouse carotid artery, which offers the possibility to study in a convenient way the molecular mechanisms of vessel remodeling and the effects of different drug coatings.

A model of stent implantation in mouse carotid artery is described. Compared to other similar methods, this procedure is very rapid, simple and accessible, offering the possibility to study in a convenient way the vascular wall reaction to different drug-eluting stents and the molecular mechanisms of restenosis.

Um modelo murino de implante de stent na artéria carótida para o Estudo da reestenose

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Adult Mouse Venous Hypertension Model: Common Carotid Artery to External Jugular Vein Anastomosis.

The understanding of the pathophysiology of brain arteriovenous malformations and arteriovenous fistulas has improved thanks to animal models. A rat model creating an artificial fistula between the common carotid artery (CCA) and the external jugular vein (EJV) has been widely described and proved technically feasible. This construct provokes a consistent cerebral venous hypertension (CVH), and therefore has helped studying the contribution of venous hypertension to formation, clinical symptoms, and prognosis of brain AVMs and dural AVFs. Equivalent mice models have been only scarcely described and have shown trouble with stenosis of the fistula. An established murine model would allow the study of not only pathophysiology but also potential genetic therapies for these cerebrovascular diseases.
We present a model of arteriovenous fistula that produces a durable intracranial venous hypertension in the mouse. Microsurgical anastomosis of the murine CCA and EJV can be difficult due to diminutive anatomy and frequently result in a non-patent fistula. In this step-by-step protocol we address all the important challenges encountered during this procedure. Avoiding excessive retraction of the vein during the exposure, using 11-0 sutures instead of 10-0, and making a carefully planned end-to-side anastomosis are some of the critical steps. Although this method requires advanced microsurgical skills and a longer learning curve that the equivalent in the rat, it can be consistently developed.
This novel model has been designed to integrate transgenic mouse techniques with a previously well-established experimental system that has proved useful to study brain AVMs and dural AVFs. By opening the possibility of using transgenic mice, a broader spectrum of valid models can be achieved and genetic treatments can also be tested. The experimental construct could also be further adapted to the study of other cerebrovascular diseases related with venous hypertension such as migraine, transient global amnesia, transient monocular blindness, etc.

We describe a method for creating a reliable model of cerebral venous hypertension in the adult mouse. This model has been widely described and tested in the rat. This new counterpart in the mice opens the possibility of using genetic modified animals and thereby broadens the applications of the model.

Adulto Rato venoso Hipertensão Modelo: artéria carótida comum para External Jugular Vein anastomose.

The understanding of the pathophysiology of brain arteriovenous malformations and arteriovenous fistulas has improved thanks to animal models. A rat model ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

Curso de modelagem em Ratos: Coagulação permanente da artéria distal Cerebral Média

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Catheterization of the Carotid Artery and Jugular Vein to Perform Hemodynamic Measures, Infusions and Blood Sampling in a Conscious Rat Model

The success of a small animal model to study critical illness is, in part, dependent on the ability of the model to simulate the human condition. Intra-tracheal inoculation of a known amount of bacteria has been successfully used to reproduce the pathogenesis of pneumonia which then develops into sepsis. Monitoring hemodynamic parameters and providing standard clinical treatment including infusion of antibiotics, fluids and drugs to maintain blood pressure is critical to simulate routine supportive care in this model but to do so requires both arterial and venous vascular access. The video details the surgical technique for implanting carotid artery and common jugular vein catheters in an anesthetized rat. Following a 72 hr recovery period, the animals will be re-anesthetized and connected to a tether and swivel setup attached to the rodent housing which connects the implanted catheters to the hemodynamic monitoring system. This setup allows free movement of the rat during the study while continuously monitoring pressures, infusing fluids and drugs (antibiotics, vasopressors) and performing blood sampling.

Vascular accesses to measure hemodynamics, provide fluids and perform blood sampling are important to any small animal model study. We present a technique for implanting catheters into the carotid artery and the common jugular vein in an anesthetized rat for connecting to a system to perform monitoring, infusions and sampling.

Cateterismo da artéria carótida e jugular para executar as medidas hemodinâmicas, infusões e Sangue de amostragem em um Rat Consciente Modelo

The success of a small animal model to study critical illness is, in part, dependent on the ability of the model to simulate the human condition. ...

Vascular Balloon Injury and Intraluminal Administration in Rat Carotid Artery

The carotid artery balloon injury model in rats has been well established for over two decades. It remains an important method to study the molecular and cellular mechanisms involved in vascular smooth muscle dedifferentiation, neointima formation and vascular remodeling. Male Sprague-Dawley rats are the most frequently employed animals for this model. Female rats are not preferred as female hormones are protective against vascular diseases and thus introduce a variation into this procedure. The left carotid is typically injured with the right carotid serving as a negative control. Left carotid injury is caused by the inflated balloon that denudes the endothelium and distends the vessel wall. Following injury, potential therapeutic strategies such as the use of pharmacological compounds and either gene or shRNA transfer can be evaluated. Typically for gene or shRNA transfer, the injured section of the vessel lumen is locally transduced for 30 min with viral particles encoding either a protein or shRNA for delivery and expression in the injured vessel wall. Neointimal thickening representing proliferative vascular smooth muscle cells usually peaks at 2 weeks after injury. Vessels are mostly harvested at this time point for cellular and molecular analysis of cell signaling pathways as well as gene and protein expression. Vessels can also be harvested at earlier time points to determine the onset of expression and/or activation of a specific protein or pathway, depending on the experimental aims intended. Vessels can be characterized and evaluated using histological staining, immunohistochemistry, protein/mRNA assays, and activity assays. The intact right carotid artery from the same animal is an ideal internal control. Injury-induced changes in molecular and cellular parameters can be evaluated by comparing the injured artery to the internal right control artery. Likewise, therapeutic modalities can be evaluated by comparing the injured and treated artery to the control injured only artery.

This protocol uses a balloon catheter to cause an intraluminal injury on the rat carotid artery and henceforth elicit neointimal hyperplasia. This is a well-established model for studying the mechanisms of vascular remodeling in response to injury. It is also widely used to determine the validity of potential therapeutic approaches.

Lesão Balloon Vascular e Administração Intraluminal em Rat Carótida

The carotid artery balloon injury model in rats has been well established for over two decades. It remains an important method to study the molecular and ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.

The FeCl3 induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.

Férrico Thrombosis Modelo rato na artéria carótida e Mesentery Vessel induzida por Chloride

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...