Supercomplexos são conjuntos supramoleculares formados por complexos de cadeia respiratória na membrana mitocondrial interna. Acredita-se que a formação desses supercomplexos confere diversas vantagens estruturais e funcionais, que incluem a diminuição da produção de espécies reativas de oxigênio, estabilização e montagem mais eficaz de complexos individuais da cadeia respiratória, regulação da atividade da cadeia respiratória e prevenção da agregação de proteínas no ambiente rico em proteínas da membrana interna. As mudanças na montagem e composição dos supercomplexos são dinâmicas, e são cada vez mais demonstradas por trás de mudanças na função mitocondrial observadas durante a adaptação fisiológica, bem como uma variedade de doenças genéticas e adquiridas.
Este vídeo apresenta um protocolo PAGE nativo híbrido claro/azul para resolver e analisar supercomplexos de forma precisa e eficaz. A principal vantagem deste método híbrido clear/blue native PAGE é que ele combina de forma otimizada vários aspectos dos protocolos tradicionais de PAGE nativos azuis e claros, o que permite reduzir a exposição a detergentes e compostos aniônicos a um mínimo em comparação com os protocolos publicados. A separação e análise ideal de supercomplexos é alcançada em grandes géis gradientes.
Este procedimento envolve várias etapas delicadas que requerem habilidades manuais e execução cuidadosa. O suporte visual ao protocolo escrito fornece dicas importantes que facilitam a implementação da técnica. Demonstrando o procedimento está Alexandria, uma estudante de doutorado do meu laboratório.
Para começar, centrifufique as mitocôndrias isoladas do tecido animal em um tubo de 1,5 mililitro a 16.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernascimento e adicione o volume calculado de tampão de extração gelada contendo digitonina no tubo para resuspendar a pelota mitocondrial. Coloque tubos em uma rotadora de mini tubo e incubar por 30 minutos a quatro graus Celsius a uma velocidade média de rotação.
Centrífuga amostras a 20, 400 vezes G por 45 minutos a quatro graus Celsius para remover fragmentos insolubilizados. Transfira o supernatante para um novo tubo no gelo. Se a eletroforese não for realizada no mesmo dia, armazene amostras a menos 80 graus Celsius.
Abra a câmara de fundição. Coloque uma placa de vidro externa de 20 centímetros na câmara. Posicione um conjunto de espaçadores de 1,5 mililitros usando a placa de alinhamento para garantir que estejam firmemente sentados contra os lados e cantos da câmara.
Coloque uma placa de vidro interna em cima dos espaçadores para formar o sanduíche de gel, e coloque uma folha de separação de plástico em cima da placa de vidro. Organize mais três montagem de sanduíche de gel. Adicione mais blocos de acrílico ou placas de vidro, se necessário, para ocupar o espaço restante na câmara.
Coloque uma faixa de parafilm na ranhura antes de colocar a junta firmemente no entalhe da junta. Coloque a placa do teto na câmara e aperte todos os seis parafusos. Fique na câmara de fundição.
Coloque o gradiente ex em uma placa de mexida com um agitador magnético na câmara de mistura de luz. Conecte a tubulação da câmara de fundição ao gradiente anterior, e fixe o tubo no da bomba peristáltica. Certifique-se de que a torneira do gradiente anterior está fechada.
Para lançar quatro géis, prepare 60 mililitros de 4% e 60 mililitros de soluções de 12% de gel em dois frascos Erlenmeyer, e gire completamente para misturar. Despeje a solução de 4% de gel na câmara de mistura de luz, e a 12% na câmara de reservatório pesada do gradiente anterior. Coloque a velocidade de agitação da placa de agitação a 350 rpm.
Em seguida, abra a torneira e ligue a bomba a 35 rpm. Uma vez que o nível de solução da fração de luz seja inferior à fração pesada, pare a bomba e abra a haste da válvula entre reservatórios leves e pesados. Deixe que as frações equilibrem o volume e reinicie a bomba.
Certifique-se de que nenhuma bolha entre no sistema e fique presa entre placas de vidro. Uma vez que o gel de gradiente esteja completamente derramado, pare a bomba e sobreponha uma água mililitro em cada sanduíche de gel para evitar a secagem do gel. Deixe polimerizar por duas horas.
Prepare gel de empilhamento de 25 mililitros no frasco erlenmeyer e redemoinho para misturar bem. Inverta delicadamente a montagem para remover água e insira pentes de 15 poços em cada sanduíche de gel. Despeje gel de empilhamento e deixe polimerizar por duas horas.
Depois disso, insira grampos de gel e sanduíche e remova o pente. Com a placa de vidro curta voltada para baixo, insira o sanduíche de gel no núcleo de resfriamento. Repita do outro lado e coloque o núcleo no tanque de eletroforese.
Despeje 300 mililitros de tampão de cátodo azul na câmara interna do tanque de eletroforese. Com uma pipeta e pontas de carregamento, carregue de 75 a 175 microgramas de proteína por poço. Em uma sala fria a quatro graus Celsius, conecte os eletrodos na fonte de alimentação e ligue-os a 150 volts, e execute gel por uma hora e meia, ou até que todas as amostras tenham entrado no gel gradiente.
Cargas replicais da amostra em poços separados para permitir a determinação paralela de atividades em gel e análise de imunobloto de complexos OXPHOS. Remova o tampão de cátodo azul com pipeta. Substitua por 300 mililitros de tampão de cátodo azul Coomassie, e execute gel a 200 volts durante a noite na sala fria.
Antes do fim da eletroforese, prepare os buffers de atividade em gel de acordo com o manuscrito, e mantenha-os no escuro à temperatura ambiente. Pare a eletroforese e recupere o gel. Corte o saco plástico para que possa ser aberto como um livro.
Corte as pistas e transfira as pistas de gel em sacos plásticos. Use um selador de calor para selar dois dos três lados. Se forem realizados experimentos de controle negativos, adicione inibidores aos buffers de ensaio.
Para três amostras experimentais, adicione 20 mililitros de tampão de atividade em gel. Remova bolhas e sele o quarto lado do saco plástico. Incubar pistas de gel a 37 graus Celsius no escuro e verificar a cada 15 minutos.
O tempo de incubação varia dependendo da quantidade de proteínas e complexos. Após a incubação, enxágue as faixas de gel na água para parar a reação, e a imagem em um fundo branco para o complexo I, complexo II, complexo IV ou fundo preto para v complexo.Por este exemplo, foi realizada uma complexa atividade intra-gel iv para visualizar supercomplexos isolados de mitocôndrias hepáticas de camundongos frescos. A quantidade ideal de digitonina para esta amostra é de quatro gramas por grama, pois fornece uma boa resolução do complexo monomédico IV, e supercomplexos de alto peso molecular.
Em uma proporção menor, as bandas não são claras e se resolvem em uma mancha durante a eletroforese, enquanto o uso de maior proporção de digitonina leva à interrupção de supercomplexos de alto peso molecular. Mitocôndrias hepáticas isoladas de um rato foram tratadas com a quantidade ideal de digitonina para extrair supercomplexos respiratórios. A mobilidade eletroforética dos complexos OXPHOS é ligeiramente reduzida quando as proteínas são separadas usando condições híbridas de PÁGINA nativa clara/azul, em comparação com page nativo padrão, devido à quantidade reduzida de azul Coomassie.
Esta mudança de mobilidade é maior para monômeros iv complexos, seguidos por monômeros V complexos, e i.O fundo azul é menor na página nativa híbrida clara/azul em comparação com o nativo azul PAGE. Altos níveis de fundo seguindo a PÁGINA nativa azul mascara completamente a coloração de atividade em gel para o complexo II, e aumenta o ruído de fundo associado à atividade de dimers iv complexos. Para este protocolo, a titulação das amostras de interesse com várias quantidades de digitonina é fundamental para identificar as condições que permitem a solubilização ideal, preservando a atividade enzimática e interações fisiológicas de proteína.
Todos os passos relativos à fundição de gel devem ser realizados meticulosamente para a formação de um gradiente ideal para a separação adequada da amostra. Também devem ser tomados cuidados extremos para a manipulação desses géis grandes e frágeis. Segure-os sempre com vários dedos usando a extremidade percentual alta do gel.
Com este método híbrido clear/blue native PAGE, as amostras só são expostas brevemente ao corante aniônico Coomassie azul no início da eletroforese sem exposição a quaisquer outros detergentes. Isso permite separar e resolver supercomplexos tão efetivamente quanto com os métodos tradicionais de PAGE nativo azul, evitando o efeito negativo dos altos níveis azuis coomassie em ensaios de atividade em gel e interações proteína-proteína labile dentro de supercomplexos. Com este protocolo, é possível, portanto, combinar medições precisas e rápidas de atividade em gel com técnicas analíticas envolvendo eletroforese 2D, imunodesetecção e/ou análise referenciada de proteômica de supercomplexos.
