Este método fornece uma alternativa eficiente à abordagem convencional baseada em analógico na obtenção de superprodutores de aminoácidos. Esta técnica compensa o método tradicional baseado em analógico, fornecendo precisão, sensibilidade e alto rendimento simultaneamente. Este método lança uma nova luz sobre a compreensão dos pontos fortes da superprodução de aminoácidos e a tradução de códons raros e poderia, teoricamente, ser aplicado a todos os microrganismos.
Este protocolo se baseia principalmente em operações experimentais moleculares básicas que são fáceis de seguir, mas podem exigir vários ensaios para alcançar a seleção adequada de stringencies de esforço. Uma demonstração visual dessa técnica oferece uma apreciação direta sobre o desempenho da seleção e um sistema de triagem na identificação dos produtores de aminoácidos. Para iniciar este procedimento, adicione o vetor nos fragmentos marcadores, no gelo, em uma razão molar de um a sete pontos cinco microliters de mistura de montagem a um volume total de dez microliters.
Incubar a 50 graus Celsius por uma hora. Transforme cinco microliters do produto de montagem em 50 microliters de células componentes a 42 graus Celsius por 30 segundos. Recupere as células no caldo Super Ideal com o meio de repressão catabólica a 37 graus Celsius por uma hora.
Em seguida, emplaque-os no meio LB Agar e incubar durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, use um kit comercial preferido para isolar o plasmídeo. Primeiro, transforme 50 microliters das células competentes com um microlitr de plasmídeo que carrega o KanR tipo selvagem.
Transforme um segundo conjunto de células competentes com o plasmídeo contendo KanR RC 29 com todos os códons leucino substituídos pelo raro codon CTA. Prato e incubar a cultura celular como descrito no protocolo de texto. Em seguida, transfira as colônias que abrigam o gene marcador de seleção do tipo selvagem no derivado rico em codons individualmente em cinco mililitros de cinco vezes diluídos meio LB contendo kanamicina a uma concentração de 50 microgramas por mililitro.
Incubar as amostras em um agitador a 37 graus Celsius enquanto treme a 250 rpm. Em seguida, transfira 200 microliters de cada uma das culturas celulares para uma placa de 96 poços em triplicado em pontos de tempo definidos. Use um leitor de placas para medir o OD600.
Inocular as manchas que abrigam o gene marcador KanR RC 29 em dois conjuntos de cinco mililitros do meio 0,2 x LB que contém kanamicina, com ou sem um suprimento de L-leucina. Adicione L-leucina a uma das mídias a uma concentração final de um grama por litro. Incubar as amostras em um agitador a 37 graus Celsius com agitação a 250 rpm e medir o OD600 para cada cultura em pontos de tempo definidos.
Para começar, transforme 50 microliters da cepa dos pais usados para mutagênese com um microliter de plasmídeo que carrega o GFP do tipo selvagem ou o PPG do tipo selvagem. Prato e incubar as culturas celulares conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, transfira as colônias individualmente para cinco mililitros do meio LB devidamente diluído.
Incubar as amostras em um agitador a 37 graus Celsius com agitação a 250 rpm. Para marcadores de fluorescência, transfira 200 microlitadores das culturas celulares para uma placa traseira inferior bem clara em triplicado em pontos de tempo definidos. Meça o OD600 na fluorescência e calcule a intensidade da fluorescência.
Para marcadores cromogênicos, meça o desenvolvimento de cores das culturas celulares. Realize o ensaio de alimentação como descrito anteriormente e meça a intensidade da fluorescência ou o desenvolvimento da cor em pontos de tempo definidos. Primeiro, transforme 50 microliters das células mutantes com um microliter do plasmídeo carregando o marcador de seleção KanR RC 29, ou os marcadores de triagem GFP RC ou PPG RC. Em seguida, centrifugar as culturas celulares a 4000 vezes G por cinco minutos.
Para seleção, descarte o supernasciente e adicione cinco mililitros de 0,2 x LB médio contendo kanamicina às células que carregam o marcador de seleção. Incubar a amostra durante a noite em um agitador a 37 graus Celsius. No dia seguinte, emplaque a cultura da noite para o 0,2 x lb ágar médio contendo kanamycin e incubar a 37 graus Celsius por 12 horas.
Para triagem, emplaque o número apropriado de células que abrigam o marcador de triagem no meio ágar LB contendo o antibiótico apropriado. Incubar a 37 graus Celsius por oito horas. Depois disso, inocular o meio LB contendo o antibiótico apropriado com cada colônia da placa.
Incubar as amostras em um agitador a 37 graus Celsius enquanto treme a 250 rpm. Meça o OD600 e a fluorescência e calcule a intensidade da fluorescência se o GFP RC for usado. Meça o desenvolvimento de cores das culturas celulares se o PPG RC for usado.
Para verificar a produtividade do aminoácido das cepas candidatas, prepare a cultura das sementes inoculando cinco mililitros de meio LB com cada uma das cepas candidatas e deixe as células crescerem durante a noite em um shaker a 250 rpm e a 37 graus Celsius. No dia seguinte, colde as células de um mililitro da cultura celular centrifugando a 4000 vezes G por dois minutos. Descarte o supernatante e resuspenque a paleta com um mililitro de água estéril.
Inocular 20 mililitros de M9 médio contendo 4% de glicose com 200 microliters da suspensão celular e incubar em um shaker de 250 mililitros a 250 rpm e a 37 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte, centrífuga um mililitro do meio cultural a 4000 vezes G por cinco minutos. Transfira 200 microliters do supernatante para um tubo limpo de 1,5 mililitro.
Prepare soluções padrão L-leucina nas concentrações aqui mostradas. Em um capô de fumaça, adicione 100 microlitadores de uma trietilamina milimillar e 100 microlitrais de um isothionato fenil molar tanto ao supernante quanto aos padrões. Misture as soluções suavemente e incuba-as à temperatura ambiente por uma hora.
Em seguida, adicione 400 microliters de n-hexano ao mesmo tubo e vórtice por dez segundos. A fase inferior contém os derivados de aminoácidos e é usada para análise hplc. Filtre a fase inferior através de 0,2 microliter politetrafluoroetileno membranas.
Depois disso, execute um microliter da amostra em um ultra HPLC equipado com uma coluna C18 com uma taxa de fluxo de 0,42 mililitros por minuto e à temperatura da coluna por 40 graus Celsius. Use um detector de matriz de diodo para detectar os aminoácidos direcionados a 254 nanômetros e calcular suas concentrações mapeando as áreas de pico sob a curva padrão. Neste estudo, os superprodutores de aminoácidos são identificados usando marcadores raros ricos em codon para alcançar simultaneamente precisão, sensibilidade e alto rendimento.
Para o sistema de seleção, deve-se observar uma redução acentuada do OD600 para cepas que abrigam o raro gene de resistência a antibióticos rico em códons em comparação com a cepa que abriga o tipo selvagem. A inibição de códon raro em expressões proteicas ocorre principalmente sob condições de fome. Após alimentação extra do aminoácido correspondente, o OD600 para a cepa que abriga o raro gene de resistência a antibióticos rico em codon aumenta significativamente.
Para o sistema de triagem, a intensidade da fluorescência no número de células fluorescentes é significativamente menor para a cepa que expressa a proteína fluorescente do raro gene rico em codon do que do gene do tipo selvagem. A alimentação do aminoácido correspondente restaurará expressões proteicas dos raros genes ricos em codon. Ao usar a proteína roxa, a cor desenvolvida a partir do raro PPG rico em códon é mais leve do que a do gene do tipo selvagem.
O meio LB não diluído permite a expressão lenta do PPG raro rico em codon sem a alimentação L-leucina na proteína roxa expressa torna-se visível uma vez que as células são pelotas. No entanto, isso não esconde o fato de que a expressão genética do raro PPG rico em códons é reforçada pela alimentação da L-leucina. A rara estratégia baseada em codon poderia identificar superprodutores dos aminoácidos alvos da biblioteca de mutação e esses mutantes devem produzir quantidades maiores dos aminoácidos alvo do que as cepas dos pais.
Ao tentar este procedimento, é importante ajustar a frequência rara de códon para obter uma clara discriminação no OD ou cor entre as células que abrigam os marcadores do tipo selvagem e os raros derivados ricos em codon. A análise de transcriptome e o sequenciamento do genoma poderiam ser aplicados às cepas selecionadas para investigar o mecanismo relacionado às produções de aminoácidos. Usando essa técnica, os superprodutores de aminoácidos poderiam ser identificados eficientemente e a análise de suas informações genéticas ofereceria novas percepções sobre seus mecanismos por trás das superproduções de aminoácidos.
A derivatização de aminoácidos pode ser prejudicial. Certifique-se de usar luvas e roupas de proteção e realizar essas etapas em um capô de fumaça.
