PAnap foi um presente amável do Dr. Peter Schultz (Scripps Research Institute). Este trabalho foi financiado pelos Institutos Canadenses de Subsídios de Pesquisa de Saúde MOP-102689 e MOP-136894 (para RB) e Canadian Foundation for Innovation Grant 950-225005.

As manipulações de rãs foram realizadas de acordo com as diretrizes canadenses e foram aprovadas pelo comitê de ética (CDEA, protocolo # 15-042) da Universidade de Montréal. 1. Preparação de mRNA para incorporação de fUAA <ol><li> Escolha um local de interesse na proteína onde mudanças conformacionais são esperadas para ocorrer. Selecione um aminoácido nesta região para substituir o fUAA. NOTA: A escolha da posição baseia-se nos rearranjos estruturais esperados. Se existir uma estrutura de alta resolução e uma hipótese dos movimentos esperados, o anap deve ser colocado de modo que o ambiente químico altere; Isto pode ser uma mudança na constante dieléctrica (ambiente hidrofóbico versus hidrofílico) ou, mais provavelmente, extinção por outro aminoácido. Os melhores quenchers são triptofanos. Anap deve estar em contato com o extintor em um estado (sobreposição do raio van-der-Waals) e livre deo outro. Se não existirem estruturas ou modelos de alta resolução, seria necessário verificar a região de interesse. Em ambos os casos, é aconselhável selecionar várias localizações próximas para aumentar a probabilidade de obter expressão e sinal de fluorescência. De modo a minimizar os efeitos estéricos durante a maturação e / ou a função da proteína, pode-se escolher substituir aminoácidos grandes e aromáticos (Phe, Trp, Tyr). Os autores, no entanto, experimentaram que a exploração de uma região de interesse para a inserção de fUAA independentemente do aminoácido substituído, é mais produtiva. </li><li> Inserir um codão de paragem âmbar (TAG) no local seleccionado utilizando a mutagénese dirigida ao local 15 . Certifique-se de que a proteína de interesse não termina num codão de paragem âmbar (TAG). Se assim for, mutar para um diferente (ocre ou opal stop codon). Amplificar, isolar e sequenciar o DNA. Obter ARNm de proteína com transcrição in vitro 16 e armazenar o mRNA a 20 ° C ou 80 ° C. </li> &lt;/ Ol&gt; 2. Preparação e Injecção de Oócitos <ol><li> Proceder à cirurgia para obtenção de oócitos da Fase V ou VI de rãs de Xenopus laevis e defolliculate com colagenase como descrito anteriormente 17 . <ol><li> Anestesiar sapos com um anestésico apropriado de acordo com o protocolo animal aprovado (aqui: éster etílico do ácido 3-aminobenzóico). Quando eles não conseguem responder a uma pitada suave para uma ponta do pé (perda de reflexo de retirada), então eles são adequadamente anestesiados para a cirurgia. </li><li> Remova imediatamente as râs da solução anestésica e lave bem a pele com água fresca. Este enxaguamento impedirá que o animal caia em níveis mais profundos de anestesia removendo o produto químico não absorvido da superfície da pele. </li><li> Remova os nós do ovário de um lado cirurgicamente e cuidadosamente abra os nós usando dois fórceps. Incubar e agitar os oócitos em &quot;solução padrão de oócito&quot; (SOS) contendo colagenase a 1% (p / v) durante 20-30 minPara defolliculate. Lavar três vezes com solução SOS. </li><li> Selecionar ovócitos grandes e saudáveis ​​individualmente e incubá-los em solução de Barth suplementada com antibióticos (100 U / mL de penicilina, 100 μg / mL de estreptomicina, 10 mg / 100 mL de canamicina) e 5% de soro de cavalo a 18 ºC por pelo menos 4 h antes da injeção . NOTA: Após 2 a 4 cirurgias com um atraso de 4 meses entre as fases, Xenopus laevis é eutanizado por incubação prolongada (&gt; 1 h) com éster etílico do ácido 3-aminobenzóico. </li></ol></li><li> Para a injeção nuclear de DNA, prepare uma ponta de injeção longa e fina para poder alcançar o núcleo e evitar danificar o oócito. Encha a ponta da injeção com óleo e monte-a no dispositivo nanoinjetor. <ol><li> Instale o nano-injector sob um microscópio estéreo e use fórceps para quebrar a extremidade da ponta. Ejetar o óleo até que não haja bolhas de ar presas dentro da extremidade da ponta. </li></ol></li><li> Colocar 1 μL de 0,1 μg /# 181; L pAnap em água livre de nuclease contendo NaOH (1% de NaOH 1 N) em um pedaço de parafilme sob um estereoscópio e encher a ponta de injeção com o DNA. </li><li> Transferir 40 oócitos para uma placa de injecção revestida com malha contendo solução de Barth suplementada com antibióticos. NOTA: Para fazer o prato de injecção revestido com malha, corte uma peça de tamanho apropriado de malha de nylon de 800 μm para encher uma placa de Petri de poliestireno. Adicionar clorofórmio para o centro e, em seguida, coloque a malha na parte superior. Segure a malha plana até que o plástico conjuntos. </li><li> Como o núcleo do oócito está localizado no pólo animal (escuro), aponte a ponta da injeção no centro do pólo animal e empalar de forma que a ponta se aproxime do centro do hemisfério animal (ou 2-3x a profundidade em relação à injeção de RNA ). Injectar 9,2 nL de pAnap no núcleo de cada oócito. A ponta fina e o pequeno volume de injeção podem resultar em injeção irregular ou ponta bloqueada. Ocasionalmente verifique se a injeção funciona injetando no ar. NOTA: Se o DNA é devidamente injetado no núcleo é incerto. Esperar, portanto, 10 - 40% dos oócitos para não expressar o par tRNA / sintetase. Ver Discussão para mais detalhes. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55598/55598fig2.jpg" /> Figura 2 : Ilustraï¿½o da injecï¿½o de ADN e ARN em Oï¿½itos de Xenopus para Anap Incorporation. Primeiro, pAnap é injetado no núcleo do oócito Xenopus ( 1 ). Após 6-24 h, Anap e canal RNA são coinjected no pólo vegetal ( 2 ). O Anap será ortogonalmente aminoacilado com o ARNt portador de um anti-codão de bloqueio âmbar, pela aminoacil-ARNt-sintetase que é codificada por pAnap. Deste modo, os Anap-ARNt aminoacilados são reconhecidos pelo ribossoma no codão de paragem âmbar inserido no canalL de ARN, resultando na supressão do codão de paragem e inserção de Anap. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="6"><li> Incubar os oócitos em 2 mL de solução de Barth suplementada com antibióticos e 5% de soro de cavalo (HS) a 18 ° C durante 6-24 h para permitir a expressão robusta de Anap tRNAs específicos e tRNA-sintetases. NOTA: O tempo de incubação do DNA pode durar vários dias antes da injeção de RNA, mas não aumenta a expressão. </li><li> Prepare o nano-injetor para injeção de RNA (o mesmo que o passo 2.2, mas a ponta da injeção não precisa ser tão fina quanto para a injeção de DNA). Trabalhe apenas sob luz vermelha a partir deste ponto para evitar o fotoblanqueio do Anap. </li><li> Misture 1 μl de Anap 1 mM com 1 μL de mRNA 1-2 μg / μL diretamente em um pedaço de parafilme e encha a ponta da injeção com a solução mista. Impala logo abaixo da membrana no(Brilhante) e injectar 46 nL em cada ovocito injectado com pAnap. NOTA: A concentração de mRNA requerida depende da proteína de interesse. </li><li> Incubar os oócitos protegidos da luz em uma caixa ou envolto em folha de alumínio, em solução de Barth suplementado com antibióticos e 5% de soro de cavalo a 18 ° C por 2-3 dias. Troque com a solução fresca de Barth todos os dias e remova os oócitos mortos para evitar contaminação. </li></ol> 3. Configuração VCF <ol><li> Instale o equipamento de aperto de tensão de oócito cortado aberto como descrito anteriormente 18 . </li><li> Montar o sistema de registro eletrofisiológico em um microscópio de fluorescência vertical, instalando a câmara de gravação em um controle deslizante que permite movê-lo entre o estereoscópio padrão para colocar o oócito eo microscópio para realizar as medições de fluorescência ( Figura 2c ). NOTA: A geometria da câmara para os oócitos cortados não é adequada para usar a tra normalNsmitted luz para iluminação durante a manipulação. Portanto, uma lâmpada halógena &quot;gooseneck&quot; com filtro vermelho é usada para iluminar lateralmente a partir do topo. O condensador do microscópio pode ser removido fazer espaço para baixar o estágio para a câmara de eletrofisiologia. </li><li> Conectar um sistema de detecção de fotodiodo à porta de saída de montagem em C do microscópio de fluorescência ( Figura 2a ). Ligue a leitora de fotocorrente a um segundo canal de entrada no processador de sinal digital (DSP, conversor analógico / digital - digital / analógico). </li><li> Use uma lâmpada de halogéneo de 100 W, 12 V como fonte de luz para a excitação de fluorescência. NOTA: Em alternativa, podem ser utilizados queimadores de Hg, mas têm de ser reduzidos em intensidade para evitar um foto-branqueamento demasiado rápido durante as gravações. A iluminação por LED só é recomendada se os respectivos LEDs apresentarem uma intensidade significativa na gama de excitação ( por exemplo, ~ 350 nm para Anap). A maioria dos LEDs brancos não atinge muito no espectro UV. </li><li> InsErt um obturador controlado eletricamente entre a fonte de luz de excitação e microscópio e conectar seu controle (tipicamente TTL-pulso) a uma saída digital do DSP. Tempo o TTL-pulso no software de gravação (consulte a documentação do fabricante), de modo que o obturador abre ~ 100 ms antes do início da gravação. Desta forma, qualquer vibração durante o processo de abertura não interfere com a gravação. O tempo depende da velocidade e vibração do obturador. Termine o pulso 5ms antes do fim da gravação como mostrado na Figura 4 . Desta forma, o valor para a fluorescência total é também registado. </li><li> Insira um cubo de filtro apropriado (filtro de excitação, espelho dicróico e filtro de emissão) na torreta do cubo do filtro. Para Anap, utilizar Passo de banda Ex: 377/50 nm, passo largo 409 nm dicroico e passo de banda Em: 470/40 nm. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55598/55598fig3.jpg" /> Figura 3 &lt;<html> / Strong&gt; : configuração VCF. ( A ) Vista lateral da configuração VCF mostrando o caminho da luz dentro do microscópio. O cubo do filtro contém um filtro de excitação, um espelho dicróico e um filtro de emissão. ( B ) As dimensões da câmara de oócito são 3,4 cm para o raio superior da câmara (1), 5,5 cm para o comprimento da câmara inferior (2), 1,4 cm para a largura da câmara inferior (3) e 1,7 cm para a largura da câmara intermédia (4). ( C ) Vista frontal da configuração VCF. O primeiro ocular à esquerda é para montar o oócito na câmara de aperto de tensão aberta e para permeabilização. Em seguida, a câmara é deslizada sob o microscópio no segundo olho para a direita. Aqui, o eléctrodo V1 é inserido no oócito utilizando o objectivo 4X, e a fluorescência é registada utilizando o objectivo 40X de imersão em água. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Itle &quot;&gt; 4. Gravação VCF <ol><li> Seguir os passos de preparação para a tensão de bloqueio de oócito cortada como anteriormente descrito e visualizado 18 (preparação da ponte de ágar, montagem do oócito, permeabilização da saponina). No entanto, trabalhar sob luz vermelha em todos os tempos para evitar o branqueamento do fluoróforo antes de gravações. Ao colocar o oócito, certifique-se de que o pólo animal está voltado para cima. A pigmentação sob a membrana polar animal protege contra a autofluorescência originária do citosol e, portanto, reduz a fluorescência de fundo. </li><li> Deslize a câmara para o microscópio e foco usando um objetivo 4X. </li><li> Empale o oócito com o eletrodo V1 (3 M KCl), mude para o objetivo 40X de imersão em água (NA 0,8 - 0,9). Foco no pólo animal que está enfrentando para cima. </li><li> Desligue a luz vermelha. Selecione o cubo do filtro direito girando a torre do cubo do filtro e a porta de saída óptica conectada ao fotodiodo. Ligue o halogéneoEn lâmpada na maior intensidade e em breve mudar o obturador aberto por 2-5 s para ler a intensidade de fluorescência de fundo originário do oócito. Com a configuração descrita o valor deve ser de cerca de 50-200 pA para Anap. </li><li> Ligue o grampo, rode o interruptor de banho / guarda para ativo e ajuste o potencial de membrana (V1 - V2) ao potencial de comando, rodando o botão na cabeça. </li><li> Selecione o potencial de retenção, o protocolo de passo, o número eo comprimento de pulsos, etc. no software de gravação. Registre as correntes dependentes da tensão e as intensidades de fluorescência Anap. </li></ol> 5. Duas cores VCF <ol><li> Para monitorizar simultaneamente duas localizações na mesma proteína, muta um aminoácido extracelular e acessível em cisteína, e remove outras cisteínas para garantir rotulagem específica com tiol-química. </li><li> Execute a etapa 2.1-2.5. </li><li> Antes das gravações VCF, incubar oócitos em TMR-maleimida 5 μM em solução de rotulagem durante 15 min (ou outro coranteCom espectros não sobrepostos comparados com Anap). </li><li> Lave os oócitos com solução de rotulagem três vezes para remover o excesso de corante. </li><li> Execute a etapa 4.1-4.6. </li><li> Insira um cubo de filtro apropriado para TMR (filtro de excitação, espelho dicróico e filtro de emissão) na torreta do cubo do filtro. Mude para o cubo do filtro TMR girando a torre do filtro. </li><li> Leia a fluorescência de fundo para TMR como descrito para Anap no passo 4.4. NOTA: O rótulo com a química tiol resulta em alta fluorescência de fundo devido à marcação inespecífica na membrana. Portanto, a fluorescência de fundo TMR pode saturar o amplificador (&gt; 2000 pA). Nesse caso, não diminua a intensidade da luz, mas simplesmente subtraia a fluorescência de fundo adicionando uma corrente de deslocamento ao fotodiodo. Em sistemas comercialmente disponíveis, use o recurso &quot;sample-and-hold&quot; no sistema detector. Observe o valor de fluorescência de fundo (usando um filtro de densidade neutra 10X) em um laboratório jComo este valor não será registrado (saturação). </li><li> Registre as correntes dependentes da tensão e as intensidades de fluorescência TMR simultaneamente, como no passo 4.6. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

A aminoacilação in vivo de tRNAs que estão continuamente a ser transcritos em conjunto com a tRNA-sintetase, torna possível obter níveis de expressão elevados para medições de fluorescência. Para a incorporação eficiente de fUAA, é crítico que o pAnap seja corretamente injetado no núcleo. Devido à incerteza da localização exacta do núcleo, espera-se que 10-40% das injecções de ADN falhem, resultando em oócitos que não expressam (ou que expressam fugas). Portanto, é importante verificar a ...

Mais de 200 aminoácidos não naturais de várias propriedades químicas e físicas foram geneticamente incorporados em proteínas em células de E. coli , leveduras e mamíferos 3 . O aminoácido não natural é incorporado em resposta a um codão de paragem específico através de um par tRNA / sintetase engendrado ortogonalmente. A abordagem genética para modificar proteínas forneceu insights valiosos sobre a estrutura ea função da proteína. Aqui, apresentamos um protocolo para o uso de Fluorometria de Voltagem-Clamp (VCF) em combinação com uma UAA fluorescente. No VCF, a observação simultânea de dados funcionais e rearranjos estruturais localizados ao redor da sonda fluorescente (~ 5 Å) nos permite obter informações dinâmicas com resolução milissegundo 1 . As sondas fluorescentes alteram o seu estado de extinção ao movimento localizado da proteína. Um movimento de apenas 1-2 Å é suficiente para levar a alterações significativas na fluorescênciaIntensidade 4 . Após a identificação do local de interesse na proteína alvo, o local é mutado por mutação pontual. Classicamente, o resíduo tinha sido mutado para uma cisteína enquanto que agora, um codão de paragem âmbar (TAG) é introduzido para a incorporação genética de fUAA. A proteína é então transcrita in vitro . Enquanto outros sistemas de expressão ( por exemplo, células de mamíferos) podem ser utilizados 5 , 6 , 7 , os oócitos de Xenopus são preferíveis para estudos de estrutura-função devido ao seu maior tamanho, levando a manipulação mais fácil e maior intensidade de fluorescência (mais fluoróforos) Ruído. Além disso, os oócitos de Xenopus têm baixa formação de proteínas endógenas 2 , 8 , ea pigmentação escura no pólo animal protege contra a fluorescência de fundo de tEle citosol. Os oócitos de Xenopus são removidos cirurgicamente e o ADN que codifica o par tRNA / tRNA-sintetase ortogonal específico para a fUAA é injectado no núcleo dos oócitos. Após um período de incubação de 6-24 h, a proteína ARN é co-injectada com a fUAA no citosol dos oócitos, seguido por um período de incubação de 2-3 dias. A fim de evitar qualquer dano ao fUAA (foto-branqueamento), os procedimentos incluindo Anap têm de ser levados a cabo sob luz vermelha para evitar a excitação do fluoróforo. Os oócitos são estudados em uma configuração de braçadeira de tensão de oócito cortada aberta, que é montada em um microscópio de fluorescência vertical, e mudanças de corrente elétrica e fluorescência são registradas simultaneamente 9 , 10 . Em alternativa, podem ser utilizadas as configurações de tensão de dois eléctrodos 1 ou de grampo-grampo 11 . A fluorescência é excitada por comprimentos de onda apropriados com baixo<html> Emissão gravada usando um fotodíodo ligado a um amplificador com alta amplificação. Existem várias vantagens do uso de aminoácidos fluorescentes não naturais (fUAAs) na fluorometria de tensão-braçadeira. Um deles é o acesso ao lado citosólico das proteínas da membrana; Muitos processos reguladores estão localizados aqui ( por exemplo, Ca2 + - ou sítios de ligação de nucleotídeos, inativação rápida e fechada de canais iónicos com voltagem, abertura de poros, acoplamento de módulo). Todos estes processos estão agora acessíveis para rotulagem fluorescente. Outra vantagem é o pequeno tamanho da sonda levando a menos perturbação da proteína. Até agora, dois pares de tRNA / tRNA sintetase ortogonais para fUAAs foram desenvolvidos 12 , 13 , onde o ácido 3- (6-acetilnaftalen-2-ilamino) -2-aminopropanóico (Anap) é o único fUAA que tem sido utilizado em oócitos de Xenopus 2 ,&quot;Xref&quot;&gt; 8. Anap é um fluoróforo ambientalmente sensível com um peso molecular de 272,3 g / mol e é apenas ligeiramente maior do que o triptofano 12 ( Figuras 1A, 1B ). Devido ao seu pequeno tamanho, é provável que sejam introduzidos menos efeitos estéricos pelo fluoróforo em comparação com os fluoróforos convencionais ligados através de um ligante (tipicamente mais do que 500 g / mol). Além disso, no caso de Anap, o fluoróforo está localizado mais próximo do esqueleto da proteína do que os ligados às cisteínas e, consequentemente, Anap está a testar rearranjos mais localizados. Finalmente, a remoção de cisteínas endógenas em VCF convencional para assegurar a marcação específica de sítio não é mais uma exigência em UAA-VCF e portanto (i) deixa as proteínas em (quase) o seu estado nativo e (ii) permite a aplicação de VCF Para estudar uma gama mais ampla de proteínas em que a função pode ser alterada pela substituição de cisteína. <img alt="figura 1" srC = &quot;/ files / ftp_upload / 55598 / 55598fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1 : Espectro de Anap e Fluorescência. ( A ) Estrutura química de Anap. ( B ) Espectro de absorção normalizado e espectros de emissão para Anap 1 nM, demonstrando a sensibilidade da fluorescência de Anap à hidrofobicidade do solvente. Os espectros de emissão foram obtidos por excitação a 350 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Uma desvantagem do uso de UAAs fluorescentes é que uma população heterogénea de proteínas pode resultar de leitura de codão de terminação, reiniciação de tradução, proteínas truncadas de terminal C ou crosstalk com aminoacilação endógena se a quantidade de tRNAs aminoacilados for escassa. Tal expressão de vazamento deve ser sempre verificada na ausência do par de ARNt / tRNA sintetase. A questão da transReinicialização lacional e como evitá-la para locais de inserção N-terminais anteriormente 14 . No entanto, quando a fUAA, tRNA e tRNA sintetase estão presentes em quantidades saturadas, só permanece uma baixa probabilidade de expressão de vazamento. A principal diferença processual entre fUAA-VCF e VCF convencional é a injecção e manuseamento dos oócitos; A injecção de ADN que codifica o ARNt e a ARNt-sintetase (pAnap) é seguida pela introdução de Anap, que é co-injectado com o ARNm da proteína ou, alternativamente, adicionado à solução de incubação como um éster de acetoximetilo (AM).

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Barth&#039;s solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>90 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td>3 mM</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-9397</td><td>0.82 mM</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7902</td><td>0.41 mM</td></tr><tr><td>Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1396</td><td>0.33 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>NaOH hydrate</td><td>BDH</td><td>BDH7225-4</td><td>pH 7.6</td></tr><tr><td>Penicilin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>100 U/mL</td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>100 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Invitrogen</td><td>15160054</td><td>10 mg/100mL</td></tr><tr><td>Horse Serum (HS)</td><td>Invitrogen</td><td>16050122</td><td>5%</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;SOS Standard Oocyte Solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td>102 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746436</td><td>3 mM</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;External recording solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L14282</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Calcium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239232</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Internal recording solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L14282</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>E478-500</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Labeling solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-1</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Calcium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239232</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;TMR stock solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR)</td><td>Molcular Probes by Life Technologies</td><td>T6027</td><td>5 mM in DMSO</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Anap stock solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anap</td><td>ABZENA (TCRS)</td><td>Custom synthesis TCRS-170</td><td>1 mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1 N</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Material/Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAnap</td><td>Addgene</td><td>48696</td><td></td></tr><tr><td>High Performance Oocyte Clamp</td><td>Dagan Corporation</td><td>CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>Gpatch Acquisition software</td><td>Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analysis software</td><td>Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recording Chamber</td><td>Custom machined</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photo diode detection system</td><td>Dagan Corporation</td><td>PhotoMax-200/PIN</td><td></td></tr><tr><td>Electrical shutter driver</td><td>UNIBLITZ</td><td>VCM-D1</td><td></td></tr></tbody></table>

voltage-clamp fluorometry in xenopus oocytes using fluorescent unnatural amino acids

A Fluorometria de Voltage-Clamp (VCF) tem sido a técnica de escolha para investigar a estrutura e função das proteínas de membrana eletrogênicas, onde as medidas em tempo real de fluorescência e correntes relatam simultaneamente rearranjos locais e função global, respectivamente. Enquanto que as técnicas estruturais de alta resolução, como a microscopia de crio-elétrons ou a cristalografia de raios-X, fornecem imagens estáticas das proteínas de interesse, o VCF fornece dados estruturais dinâmicos que nos permitem relacionar os rearranjos estruturais (fluorescência) com dados funcionais dinâmicos (eletrofisiologia). Até recentemente, a química tiol-reactiva utilizada para a marcação fluorescente dirigida ao local das proteínas restringia o âmbito da abordagem porque todas as cisteínas acessíveis, incluindo as endógenas, seriam rotuladas. Foi assim necessário construir proteínas isentas de cisteínas endógenas. A rotulagem também se restringiu a locais acessíveis a partir dolado. Isto mudou com o uso de Aminoácidos Não-naturais Fluorescentes (fUAA) para incorporar especificamente uma pequena sonda fluorescente em resposta à supressão do codão de paragem utilizando um par ortogonal de tRNA e tRNA sintetase 2 . A melhoria do VCF requer apenas um procedimento de injeção de dois passos de injeção de DNA (par tRNA / sintetase) seguido por co-injeção de ARN / fUAA. Agora, a rotulagem tanto intracelular e locais enterrados é possível, eo uso de VCF se expandiu significativamente. A técnica VCF torna-se assim atraente para o estudo de uma vasta gama de proteínas e, mais importante, permite investigar numerosos mecanismos reguladores citosólicos.

A Figura 4 mostra um exemplo de gravações de VCF obtidas a partir de um ovócito que expressa canais de Shaker com inactivação rápida removida (IR), L382stop-W434F na presença de pAnap e Anap. A mutação W434F bloqueia as correntes iônicas de potássio, o que torna possível medir os deslocamentos transitórios de carga de gating (correntes de gating). As gravações simultâneas das correntes de passagem (traçado superior) e das alterações de intensidade de f...

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Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Este artigo descreve um aumento da Fluorometria Voltagem-Clamp convencional (VCF) onde Fluorescente Aminoácidos Não-naturais (fUAA) são usados ​​em vez de corantes maleimida, para sondar rearranjos estruturais em canais iônicos. O procedimento inclui injeção de DNA de oócito de Xenopus , coinjeção de ARN / fUAA e medições simultâneas de corrente e fluorescência.

Braçadeira de tensão Fluorometria em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos Usando Aminoácidos Fluorescentes Não-naturais

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

voltage-clamp-fluorometry-xenopus-oocytes-using-fluorescent-unnatural

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

10.4K visualizações.  University of Montréal.  Este artigo descreve um aumento da Fluorometria Voltagem-Clamp convencional (VCF) onde Fluorescente Aminoácidos Não-naturais (fUAA) são usados ​​em vez de corantes maleimida, para sondar rearranjos estruturais em canais iônicos. O procedimento inclui injeção de DNA de oócito de Xenopus , coinjeção de ARN / fUAA e medições simultâneas de corrente e fluorescência. 

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Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Gravação de patch-clamp de canais iônicos Expresso em Oócitos Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Biologia

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation of the guidance receptors is the first step of the signaling mechanisms allowing axon tips, the growth cones, to respond to the ligands. As such, the modulation of their availability at the cell surface is one of the mechanisms that participate in setting the growth cone sensitivity. We describe here a method to precisely visualize the spatio-temporal cell surface dynamics of an axon guidance receptor both in vitro and in vivo in the developing chick spinal cord. We took advantage of the pH-dependent fluorescence property of a green fluorescent protein (GFP) variant to specifically detect the fraction of the axon guidance receptor that is addressed to the plasma membrane. We first describe the in vitro validation of such pH-dependent constructs and we further detail their use in vivo, in the chick spinal chord, to assess the spatio-temporal dynamics of the axon guidance receptor of interest.

We describe here the use of a pH-sensitive green fluorescent protein variant, pHluorin, to study the spatio-temporal dynamics of axon guidance receptors trafficking at the cell surface.&#160;The pHluorin-tagged receptor is expressed both in cell culture and in vivo, using electroporation of the chick embryo.

Uso de pHluorin para avaliar a dinâmica dos receptores de orientação de axônio na cultura celular e no embrião de filhotes

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Neurociência

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Imagem fluorescente de cálcio e subsequente hibridização em Situ para caracterização do precursor neuronal em xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Biologia do Desenvolvimento

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate goal is to image neuronal activity in vivo, one must be able to image activity of a single cell to ensure successful in vivo preparations. This procedure will describe how to image membrane potential in a single cell to provide a foundation to eventually image in vivo. Here we describe methods for imaging GEVIs consisting of a voltage-sensing domain fused to either a single fluorescent protein (FP) or two fluorescent proteins capable of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) in vitro. Using an image splitter enables the projection of images created by two different wavelengths onto the same charge-coupled device (CCD) camera simultaneously. The image splitter positions a second filter cube in the light path. This second filter cube consists of a dichroic and two emission filters to separate the donor and acceptor fluorescent wavelengths depending on the FPs of the GEVI. This setup enables the simultaneous recording of both the acceptor and donor fluorescent partners while the membrane potential is manipulated via whole cell patch clamp configuration. When using a GEVI consisting of a single FP, the second filter cube can be removed allowing the mirrors in the image splitter to project a single image onto the CCD camera.

A method for imaging changes in membrane potential using genetically encoded voltage indicators is described.

Membrana de imagem Potencial com dois tipos de sensores de tensão fluorescentes geneticamente codificados

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

Examinando o Dynamics Conformacional de Proteínas de Membrana In situ Com Labeling-Site dirigido Fluorescência

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Bioengenharia

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as accessibility to numerous imaging approaches, electrophysiological techniques and behavioral assays. The Xenopus tadpole olfactory system is particularly well suited to investigate the function of synapses established during normal development or reformed after injury. Here, we describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae. We outline a combination of in vivo measurements of presynaptic calcium responses in glomeruli of the olfactory bulb with olfactory-guided behavior assays. Methods can be combined with the transection of olfactory nerves to study the rewiring of synaptic connectivity. Experiments are presented using both wild-type and genetically modified animals expressing GFP reporters in central nervous system cells. Application of the approaches described to genetically modified tadpoles can be useful for unraveling the molecular bases that define vertebrate behavior.

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system in vivo. We describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae in normal rearing conditions or after injury.

Avaliação funcional das vias olfativas vivos Xenopus girinos

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

Medindo o transporte de catiões de Na, K e H, K-ATPase em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos por espectrofotometria de absorção atômica: uma alternativa para Ensaios de Radioisótopos

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

O<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Cut-aberto vaselina Gap Técnica Voltage-clamp Com Fluorometria

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Braçadeira de tensão Fluorometria em

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