Este protocolo fornece uma alternativa poderosa para a triagem da atividade nuclease como biomarcador da doença, com uma metodologia fácil de implementar até mesmo para pesquisadores que não são tão especializados em sondas de ácido nucleico. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de selecionar sondas de ácido nucleico que possam identificar atividades nuclease conhecidas e desconhecidas, aproveitando a interação dinâmica sonda-nuclease. Outras vantagens dessa metodologia são sua flexibilidade, alta reprodutibilidade e facilidade de uso.
A demonstração será realizada por Khadija, uma estudante de mestrado, e Baris, um pós-doutor do nosso laboratório. Ao projetar uma biblioteca de oligonucleotídeos, inclua pelo menos um DNA e uma sequência aleatória de RNA contendo uma combinação de adenina, guanina, citosina e tiamina ou uracil. Para preparar as sondas de oligonucleotídeos, gire as sondas de oligonucleotídeos liofilizadas e dilua cada sonda no buffer Tris-EDTA a uma concentração de 500 picomolares por microlitera para evitar a degradação da nuclease.
Para a cultura bacteriana em meio sólido, enrole uma única conta de vidro porosa do armazenamento criogênico diretamente em um prato de cultura contendo TSA complementado com sangue de ovelha desfibriado para exalar colônias bacterianas individuais. Em seguida, coloque a placa a 37 graus Celsius por 24 horas. Para a cultura bacteriana em meio líquido, transfira uma única colônia de uma cultura média sólida para 50 mililitros de TSB para incubação a 37 graus Celsius por 24 horas a 200 rotações por minuto.
No dia seguinte, diluir a cultura em uma proporção de 1 a 500 em TSB fresco e incubar as bactérias por mais 24 horas a 37 graus Celsius e 200 rotações por minuto em uma incubadora de agitação. Para configurar um ensaio de atividade nuclease, primeiro pré-aqueça um fluorômetro a 37 graus Celsius e adicione cuidadosamente 96 microliters de TSB estéril ou supernacido de uma cultura média líquida Salmonella ou E.Coli para um tubo microcentrifuge sem nuclease sem nuclease por sonda. Adicione quatro microliters de solução de trabalho da sonda a cada tubo e use uma pipeta para misturar completamente o conteúdo de cada tubo até que sejam alcançadas soluções homogêneas, tomando cuidado para evitar bolhas.
Em seguida, carregue cuidadosamente 95 microliters de cada solução perto da parede de poços individuais de uma placa de fundo preto, não tratada 96, tomando cuidado para evitar bolhas. Quando todas as soluções tiverem sido adicionadas, cubra a placa e inspecione visualmente a tampa em busca de marcas de caneta ou poeira que possam introduzir artefatos de medição. Para configurar o software para medição de atividade nuclease, abra um programa de software de aquisição adequado.
Selecione Ler agora na janela Gerenciador de tarefas e selecione Novo para criar o protocolo de medição cinética. Clique em Definir temperatura para selecionar 37 graus Celsius e confirmar e salvar as configurações clicando em OK. Clique em Iniciar Cinética. Na janela pop-up, selecione duas horas na caixa de entrada Run Time e dois minutos na caixa de entrada de intervalo antes de clicar em OK para confirmar e salvar as configurações.
Clique em Ler. Na janela pop-up, selecione a intensidade da fluorescência como o Método de Detecção, o Kinetic endpoint como o Tipo de Leitura e Filtros como o Tipo óptico. Em seguida, clique em OK. Na janela pop-up, selecione Verde no conjunto de filtros e clique em OK. Na janela Procedimento, selecione Usar tampa e clique em Validar.
Uma janela pop-up aparecerá confirmando que o protocolo criado é válido. No menu Protocolo, selecione Procedimento. Na janela Procedimento, defina os poços a serem medidos e digite o nome do experimento na caixa de entrada nome de arquivo.
Em seguida, carregue a placa no leitor da placa, tomando cuidado para que a placa esteja na orientação certa e clique no botão Ler Novo para iniciar a aquisição. Para análise de dados, abra os dados no software de análise apropriado e selecione um dos poços medidos na placa de uma janela. Clique em Selecionar poços e inclua todos os poços medidos na janela Diálogo de Seleção de Poços antes de clicar em OK. Em seguida, selecione Dados na placa de uma janela para visualizar os resultados tabulados e clique em QuickExport para exportar os dados para uma planilha.
Em uma planilha, rotule as colunas de dados como apropriadas para cada amostra e sonda e plote as unidades relativas de fluorescência versus tempo para que os dados gerem gráficos cinéticos. Neste experimento representativo, após a primeira rodada de triagem, os supernacantes da cultura Salmonella relataram uma clara preferência por sondas de RNA sobre as sondas de DNA. Com base na identificação do RNA como o tipo de ácido nucleático preferido pelos núcleos salmonella, uma nova biblioteca somente de RNA foi projetada para ser usada na segunda rodada de triagem.
Em contraste, e.Coli em controles médios de cultura demonstrou uma capacidade muito limitada de degradar sondas RNA. Após uma segunda rodada de triagem usando nucleotídeos quimicamente modificados com o objetivo de aumentar a especificidade das sondas de RNA, rna pyrimidina 2'O-metil e RNA purina 2'O-metil poderia ser identificado com base em suas modificações químicas como exibindo o melhor desempenho do comportamento cinético quando comparado com o RNA pyrimidine 2'fluoro e RNA purina 2'fluoro fluoro respectivamente. Esses resultados sugerem que Salmonella tem uma atividade RNAse importante com preferência diferencial de química de substrato que pode ser usada para selecionar sondas capazes de reconhecer especificamente essa bactéria.
Este procedimento permite a seleção de sondas capazes de identificar atividades nuclease associadas a condições da doença, como câncer ou infecção bacteriana, permitindo o desenvolvimento de novas ferramentas de diagnóstico clínico.
