Este método melhora a entrega de ácidos graxos às células e os protege dos efeitos tóxicos da entrega gratuita de ácidos graxos, garantindo assim uma rotulagem mais consistente. A sensibilidade e a eficiência da detecção da química de cliques dependem da absorção efetiva do rótulo de ácido graxo. Mostramos que isso pode ser melhorado em grande parte.
Várias etapas do protocolo são muito específicas e precisam ser seguidas de perto. Uma demonstração visual pode esclarecer e mostrar, por exemplo, como evitar a formação de sólidos na mistura de rotulagem. Para preparar a mídia de rotulagem, suplementar o DMEM com FBS revestido de 5%dextran/carvão, estreptomicina de penicilina 1X, dois milimolar l-glutamina e 100 milimões de sódio piruvato, depois pré-aquecimento para 37 graus Celsius antes do uso.
Lave suavemente as células T HEK-293 banhadas um dia antes em um prato de cultura de tecido de seis poços com PBS e, em seguida, substitua o PBS por mídia de rotulagem. Incubar as células a 37 graus Celsius com dióxido de carbono de 5% por aproximadamente 45 minutos antes de proceder à rotulagem metabólica com ácidos graxos. Para saponificar os análogos do ácido graxo, pipeta pelo menos dois microliters do ácido graxo alquila analógico diretamente no fundo de um frasco de reação cônica de três mililitros.
Pipeta uma quantidade igual de hidróxido de potássio diluído perto do fundo do frasco de reação na borda do vidro de tal forma que o volume dispensado do hidróxido de potássio se mistura com o ácido graxo. Feche a tampa do frasco e toque delicadamente para misturar as soluções. Aqueça o frasco de reação a 65 graus Celsius por aproximadamente cinco minutos ou até que a solução fique clara, indicando que o ácido graxo foi incorporado.
No entanto, tome cuidado para que o líquido não evapore muito. Em seguida, a pipeta pré-aquecida 20% de BSA sem ácidos graxos de tal forma que a razão de volume de ácidos graxos para hidróxido de potássio para BSA livre de ácidos graxos é 1-1-50, alcançando uma concentração final de ácidos graxos alquilo ligados à BSA de 20X. Misture a solução pipetando para cima e para baixo, em seguida, incuba-la por 15 minutos a 37 graus Celsius.
Rotule as células T HEK-293 adicionando o ácido graxo 20X BSA conjugado diretamente na mídia de fome para alcançar uma concentração final de 1%BSA em 25 micromolar alquilanito ou 100 mílamo alkynyl palmitato e estearato de alkynyl. Para comparação, adicione líquidos não saponificados ao escoar dois microliters de ácido graxo não rotulado diretamente na mídia de fome, em seguida, coloque as células de volta na incubadora por três a seis horas. Depois que a incubação estiver completa, lave suavemente as células com PBS à temperatura ambiente, depois colde elise as células adicionando 500 microliters EDTA-free tampão RIPA modificado e girando os lysates por 15 minutos a quatro graus Celsius.
Centrifugar os lises a 16.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius, depois coletar o supernatante em tubos de microcentrifuuge de 1,7 mililitro e armazená-los a menos 20 graus Celsius. Leve de 50 a 100 microgramas de proteínas em tubos de microcentrífugo de 1,7 mililitro para um volume igual usando o buffer RIPA modificado sem EDTA. Mantenha o volume de reação o menor possível.
Adicione STS a cada amostra para obter uma concentração final de 1%Prepare uma mistura mestre dos reagentes de clique e adicione volumes apropriados nos lises, em seguida, misture por pipetação para cima e para baixo. Incubar os lises no escuro por 30 minutos em um banho de água de 37 graus Celsius com mistura ocasional. Para imunoprecipitação, misture os linces com o anti-GFP do coelho e incubar durante a noite com rotação a quatro graus Celsius.
Adicione 15 a 20 microliters de contas magnéticas pré-equilibradas com RIPA de 0,1% SDS a cada tubo e permita que ele reaja finalmente ao final a quatro graus Celsius por três horas. Lave as contas com tampão de lise e resuspend em 45 microlitres de 50 mililitros de tampão HEPES contendo 1%SDS. Aqueça as contas a 80 graus Celsius por 15 minutos.
Durante a incubação, inverta ou agitar os tubos aproximadamente a cada cinco minutos, em seguida, gire brevemente todos os tubos. Enquanto as amostras ainda estão quentes, colete o supernascante contendo as proteínas. Combine 43 microliters do supernatante com sete microlitres da mistura mestre de reagentes de clique e permita que eles reajam no escuro por 30 minutos a 37 graus Celsius.
Em um enredo ocidental, observou-se um efeito perceptível na eficiência de rotulagem para a detecção de química de cliques entre os ácidos graxos alquilo de saponificados e não saponificados com um comprimento crescente das cadeias de aciis. Em células rotuladas com estearato de alquila, a saponificação do ácido graxo e a entrega com BSA para rotulagem metabólica aumentaram drasticamente a detecção de sinal de proteína S-acylated através da química do clique e detecção por um azitoprobe fluorescente, sugerindo um aumento geral na incorporação celular do rótulo de ácido graxo alquilo. Por outro lado, não foi observada diferença perceptível nas células tratadas com o mais curto e solúvel ácido graxo alkynyl myristate.
As células rotuladas com palmitato alkynyl apresentaram um aumento intermediário no rótulo em comparação com o myristate alkynyl, mas menos do que o estearato de alquila. É importante ressaltar que o tratamento de membranas PVDF com hidróxido de potássio molar 0.1 removeu em grande parte os rótulos de ácidos graxos de células incubadas com palmitato alquila e estearato de alquila, confirmando que a maior parte do sinal foi através de uma ligação éster ou thioester. Como esperado, a incorporação do myristato alquilo foi principalmente resistente à alcalina devido à fixação do mirristato às proteínas através de uma ligação amida.
Após a química do clique, a mistítilação do tipo selvagem myristoylated C-terminal Huntington GFP foi detectada nos imunoprecipitados, bem como nos lysates, enquanto a mutação G2A bloqueou completamente a miristoitação do terminal C-Huntington GFP. Após a química do clique, podemos realizar a purificação de afinidade de proteínas acicladas gordurosas para espectrometria de massa. Isso pode produzir um perfil diferente de proteínas aciclantes gordurosas protegendo as células da toxicidade.
