O tecido adiposo perivascular envolve os vasos sanguíneos e regula a fisiologia cardiovascular. Este protocolo é usado para responder a perguntas-chave relacionadas à função de progenitores adiposos humanos no microambiente vascular. As células progenitoras adiposas variam de acordo com sua localização anatômica.
Mostramos que uma população de progenitores multipotentes pode ser derivada com sucesso do tecido adiposo perivascular de pacientes com doenças cardiovasculares. Demonstrando o procedimento estará Spencer Scott, um estudante de medicina do meu laboratório. Obtenha um pedaço de 500 miligramas de Tecido Adiposo Perivascular Humano ou PVAT da sala de cirurgia, conforme descrito no protocolo de texto.
Transfira pvat humano fresco do DMEM para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 25 mililitros de solução antibiótica. Incubar com balanço por 20 minutos a quatro graus Celsius. Enquanto o PVAT está em solução de antibióticos, descongele uma alíquota de tampão de dissociação a 37 graus Celsius.
Adicione 50 microliters de 100x de solução antibiótico/antimíctico a cinco mililitros de tampão de dissociação e esterilize usando um filtro de seringa de 0,22 mícrons. Adicione um mililitro de solução de gelatina a um poço de uma placa de 24 poços. Em uma capa de fluxo laminar, use fórceps estéreis e tesouras para transferir PVAT da solução antibiótica para uma placa de Petri estéril.
Adicione um mililitro de tampão de dissociação pré-aquecido ao tecido. Finamente pica o tecido inteiro em um chorume usando fórceps estéreis e tesouras de dissecção. Transfira o chorume de um mililitro para quatro mililitros de tampão de dissociação.
Incubar o tubo de lado em um agitador orbital pré-aquecido de 37 graus Celsius a 200 rpm por uma hora. Após uma hora, não devem estar presentes pedaços de tecido visíveis e a solução aparecerá como uma suspensão celular nublada. Filtre a solução através de um conjunto de filtro de células de 70 mícrons em cima de um tubo cônico de 50 mililitros.
Enxágüe o coador com mais 10 mililitros de solução antibiótica para capturar o maior número possível de células. Não aperte o coador. Agora, pelota as células por 12 minutos a 300 vezes g em uma centrífuga de balde balançando.
Após a centrifugação, o tubo será separado em uma camada superior gordurosa de adipócitos, uma interfase e uma pelota. A pelota é a fração vascular estromal contendo células endoteliais, células imunes, células sanguíneas e células progenitoras. Resuspense a pelota em 10 mililitros de HBSS e centrífuga por cinco minutos a 300 vezes g.
Repita esta etapa para um total de duas lavagens no HBSS. Agora aspire a gelatina de uma placa de 24 poços. Lave suavemente o poço uma vez com HBSS para remover a gelatina sem saída.
Resuspend a pelota de fração vascular estromica com glóbulos vermelhos intactos em um mililitro de crescimento médio e sementes no poço revestido de gelatina. Em seguida, adicione FGF2 humano a uma concentração final de 25 nanogramas por mililitro no meio da cultura. Incubar por 24 horas a 37 graus Celsius com 5% de CO2.
Depois de cultivar as células por 24 horas, remova a mídia de crescimento e lave as células cinco vezes com HBSS. Esta etapa de lavagem remove glóbulos vermelhos e células mortas. Em seguida, adicione um mililitro de nova mídia de crescimento complementada com 25 nanogramas por mililitro FGF2 a cada poço.
Mude a mídia a cada 48 horas certificando-se de complementar com 25 nanogramas por mililitro fgf2 fresco cada vez. As células de passagem atingem 100% de confluência de 7 a 10 dias após a explantação. Para isso, aspire a mídia de crescimento e lave a monocamadas duas vezes com um MILilitro HBSS.
Aspire todos os HBSS dos poços e adicione algumas gotas de solução de dissociação celular. Bata e gire a placa várias vezes e incubar a 37 graus Celsius com 5%de CO2 por cinco a sete minutos para levantar as células. Em seguida, adicione aproximadamente um mililitro de meio de cultura fresca às células separadas.
Distribua 500 microlitadores das células isoladas para dois poços de uma placa de 24 poços cada contendo 500 microliters de mídia de crescimento e 25 nanogramas FGF2. Além disso, cultura células-tronco mesenquimais de medula óssea humana ou colônias MSC como descrito no protocolo de texto. Emplaque os números apropriados de células derivadas de medula óssea e PVAT por poço de uma placa de 12 poços.
Para condições adipogênicas e osteogênicas, chapa aproximadamente 200.000 a 225.000 células por poço. Considerando que para condições condrogênicas, placa 150.000 a 175.000 células por poço. Em seguida, dissociar células tanto da população de células progenitoras pvat humanas quanto da população de MSC da medula óssea humana adicionando solução de descolamento celular.
Incubar as células na solução de desprendimento a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por cinco minutos. Puxe as populações para 15 mililitros cônicos separados. Gire os frascos para baixo a 500 vezes g durante sete minutos para pelotar as células.
Em seguida, resuspense as células em um mililitro de PBS e use um hemótmetro para estimar o número da célula. Emplaque as células em pratos de 12 poços como antes. Forneça pratos separados para as condições adipogênicas e osteogênicas induzidas e não induzidas.
E adicione 1,5 mililitros de mídia de condução adipogênica e osteogênica a cada poço da condição induzida. Em seguida, adicione 1,5 mililitros de mídia não indutiva adipogênica e osteogênica a cada poço da condição não induzida. Iniciar a incubação das populações celulares induzidas por adipogênicos e osteogênicos e não induzidas a 37 graus Celsius e 5%DE CO2.
Gire o volume restante de células progenitoras PVAT humanas e MSCs de medula óssea humana por sete minutos a 500 vezes g. Determine o volume necessário para resuspensar as demais pelotas de células derivadas da medula óssea e pvat para atingir uma densidade de 100.000 células por 10 microliters. Em seguida, resuspenque as pelotas no volume calculado de mídia de crescimento msc para indução de linhagem condrogênica.
Mova suavemente o volume de células para cima e para baixo usando uma pipeta para garantir uma distribuição homogênea. Agora pipeta uma gotícula de 10 microliter da solução celular concentrada no centro de cada poço para formar uma micro massa de 100.000 células. Coloque um mililitro de água estéril no poço adjacente para evitar a evaporação.
Incubar as micro culturas de massa por duas horas a 37 graus Celsius e 5% de CO2 para permitir que a micro massa se acumule. Após duas horas, adicione cuidadosamente a mídia de diferenciação condrogênica cravada com 10 nanogramas por mililitro humano TGF-beta-um para cada um dos poços de condição induzido. Agora adicione cuidadosamente 1,5 mililitros da mídia não indução aos poços de condição não induzidos.
Raspe ou despeje a micro massa na condição condrogênica induzida em um, a fim de desidratar, incorporar e manchar a amostra conforme descrito no protocolo de texto. Estudos de diferenciação adipogênica foram realizados em paralelo com as células progenitoras derivadas da medula óssea humana e das células progenitoras derivadas do PVAT. Na condição não induzida, nenhum acúmulo lipídudo é evidente.
Isso contrasta com a condição induzida mostrada após a coloração de lipídios neutros com O.Óleo Vermelho Enquanto o grau de diferenciação nas células derivadas de PVAT aórticos humanos é mais robusto, ambas as fontes celulares humanas apresentaram a capacidade de diferenciar para a linhagem adipogênica. O protocolo de diferenciação osteogênica foi utilizado para MSCs derivados da medula óssea humana e células derivadas de PVAT. As células não induzidas não mancharam com Alizarin Red.
Após o protocolo de diferenciação osteogênica, os MSCs humanos desenvolveram nódulos calcificados que manchavam com Alizarin Red, enquanto as células Aórticas Humanas PVAT não. As células derivadas tanto dos MSCs de medula óssea humana quanto do PVAT humano apresentaram características características da diferenciação condrogênica com acúmulo abundante de colágeno na micro massa. A micro massa é formada a partir de MSCs de medula óssea humana e células derivadas de PVAT aórticas também apresentaram acúmulo abundante de glicosaminoglicanos, conforme indicado pela coloração azul alciana.
Morfologicamente, estruturas semelhantes a lacunas foram detectadas com células sentadas em cavidades cercadas por deposição de colágeno. É fundamental picar finamente o tecido adiposo perivascular antes da dissociação enzimática e garantir que as densidades celulares adequadas sejam banhadas para cada ensaio de diferenciação de linhagem. Após este procedimento, o PCR quantitativo combinado com a bolha ocidental e a citometria de fluxo devem ser usados para caracterizar marcadores específicos de linhagem de progenitores diferenciados de fontes de adipose perivascular e medula óssea.
Com essa técnica, podemos começar a entender os mecanismos que regulam a expansão e disfunção do tecido adiposo perivascular durante a obesidade e as implicações que as células progenitoras têm sobre a função vascular e as doenças cardiovasculares.
