O protocolo aqui descrito permite a geração de bibliotecas de RNA de comprimento total mutagenizadas aleatoriamente de genomas virais de RNA positivo de fita simples de até 10 kilobytes de comprimento e a seleção de fenótipos de interesse sob condições experimentais desejadas. Esta técnica pode criar bibliotecas de RNA viral de comprimento total com diferentes níveis de diversidade genética em um curto espaço de tempo usando uma abordagem livre de clonagem. A técnica utiliza reagentes baratos e amplamente disponíveis para a síntese de bibliotecas.
Quem demonstrará o procedimento será Shaheen Khan, estudante de doutorado da Seção de Virologia do Departamento de Ciências da Vida da Universidade Shiv Nadar. Para começar, realize ep-PCR preparando a mistura mestre para quatro conjuntos de experimentos com primers forward e reverse juntamente com os componentes de reação sem o modelo pJFH1, conforme descrito no manuscrito do texto. Alíquota a mistura master em quatro tubos.
Adicione 100 nanogramas, 50 nanogramas, 25 nanogramas e 10 nanogramas do molde nos tubos individuais e ajuste o volume total da reação para 50 microlitros. Aplique as condições de ciclagem para amplificar um fragmento de 97 pares de 36 bases. Estimar o produto da ep-PCR amplificado carregando cinco microlitros dos produtos da PCR e comparando-o com quantidades conhecidas de uma escada de DNA de quilobase executando uma eletroforese em gel de agarose à base de TAE a 0,8%.
Purificar o produto usando um kit de purificação de coluna. Estimar a concentração do produto purificado medindo a absorbância a 260 nanômetros. Concentrar a vácuo o produto ep-PCR para obter uma concentração do produto igual ou superior a 100 nanogramas por microlitro.
Configure uma reação de síntese de RNA in vitro e coloque-a a 37 graus Celsius para incubação. Em seguida, purifice o produto sintetizado usando um kit de purificação de coluna. Configure uma reação de síntese de cDNA de 20 microlitros adicionando aproximadamente um micrograma do RNA viral, cinco primers reversos micromolares e 200 unidades de transcriptase reversa, de acordo com as recomendações do fabricante.
Usando o cDNA, prepare uma mistura de reação conforme descrito no manuscrito do texto e execute um ciclo de amplificação. Execute o produto em um gel de agarose à base de 0,8% TAE para confirmar o tamanho do produto de 25 pares de 71 bases e, em seguida, purifice o produto usando um kit de purificação de coluna, conforme demonstrado anteriormente. Elute em 40 microlitros de água estéril.
Para adicionar uma saliência A de três primos, adicione 0,5 DATP micromolar e uma unidade de Taq DNA polimerase de baixa fidelidade e incube todo o produto de PCR a 70 graus Celsius por 30 minutos, juntamente com 1X tampão de PCR e cloreto de magnésio 1,5 milimolar. Em seguida, purifice a mistura usando um kit de purificação de coluna. Estabeleça a reação de ligadura e incube-a à temperatura ambiente por três horas.
Em seguida, adicione 100 microlitros de Escherichia coli DH5-Alpha ao DNA ligado e choque térmico as células a 42 graus Celsius por 35 segundos. Adicione um mililitro de meio LB à suspensão celular e incube com agitação suave por uma hora a 37 graus Celsius. Centrífuga a 13.800 RCF.
Descarte o sobrenadante e ressuspenda em 200 microlitros de meio LB fresco. Placa de 100 microlitros das células de E.coli DH5-Alpha transformadas em uma placa LB contendo 50 microgramas por mililitro de ampicilina e incubar a 37 graus Celsius por 16 horas. Configure mini preparações de 25 a 30 colônias em cinco mililitros de meio LB contendo 50 microgramas por mililitro de ampicilina e cresça durante a noite a 37 graus Celsius.
No dia seguinte, extrair os plasmídeos com um kit comercial e realizar a digestão da enzima de restrição em volume de 10 microlitros com 200 nanogramas dos plasmídeos isolados, duas unidades de EcoR1 e tampão de restrição 1X para todas as colônias. Depois de incubar as misturas de digestão a 37 graus Celsius por três horas, carregar os produtos em gel de agarose à base de TAE 0,8% para confirmar a inserção de DNA plasmidial. Realizar o sequenciamento de Sanger dos plasmídeos de 25 clones positivos utilizando os primers recomendados.
Um dia antes da transfecção, dividir as células e contar o número de células viáveis usando um hemocitômetro. Em seguida, semeie o hepatoma humano 7,5 células em placas de 35 milímetros em dois mililitros de DMEM completo e incube as células a 37 graus Celsius por 16 horas em uma incubadora umidificada com dióxido de carbono a 5%. No dia seguinte, preparar o complexo lipídico transcrito diluindo 10 microlitros de reagente de transfecção em 50 microlitros do meio essencial mínimo e, separadamente, diluir cinco microgramas de transcritos virais em 50 microlitros do meio essencial mínimo.
Incubar ambas as misturas à temperatura ambiente durante 10 minutos. Em seguida, misture-os em um único tubo de microcentrífuga estéril e incube a mistura à temperatura ambiente por 30 minutos. Após a incubação celular, remova o meio de cultura, lave as células duas vezes com PBS 1X pré-aquecido e adicione 1,5 mililitros do meio essencial mínimo.
Adicione lentamente o complexo e gire suavemente o prato para uma distribuição uniforme. Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante 10 horas. Em seguida, remova o meio.
Lave as células transfectadas duas vezes com um mililitro pré-aquecido 1X PBS, e adicione dois mililitros de DMEM completo. Isolar o RNA viral de 140 microlitros de sobrenadantes de cultura usando um kit de isolamento de RNA viral. Configure uma reação qRT-PCR de 10 microlitros usando um kit comercial de qRT-PCR.
Use os primers e a sonda forward e reverse para quantificação do RNA do HCV. Defina o ciclo de reação para 48 graus Celsius por 20 minutos, 95 graus Celsius por 10 minutos e 45 ciclos de 95 graus Celsius por 15 segundos e 60 graus Celsius por um minuto. Execute as reações e configure controles negativos.
Em paralelo, gere uma curva padrão usando um número de cópias conhecidas diluído em série de dez vezes de transcritos do HCV para quantificar o RNA viral. Realizar em triplicata. Placa de hepatoma humano 7,5 células em uma placa de 96 poços e incubar as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono a 5% aproximadamente 16 horas antes de adicionar o vírus.
Em um gabinete de biossegurança Classe II, realize diluições seriadas dez vezes maiores do vírus. Adicione 100 microlitros do vírus diluído por poço para infectar as células e incube-as a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%. Após três dias, lavar as células infectadas três vezes com 0,1 mililitros de PBS e fixar e permeabilizar as células com 0,1 mililitros de metanol gelado a menos 20 graus Celsius por 20 minutos.
Lave os poços com 1X PBS três vezes e, em seguida, 1X com PBST. Após a remoção do PBST, bloquear as células por 30 minutos à temperatura ambiente com 0,1 mililitros de BSA 1% contendo 0,2% de leite desnatado em PBST. Remova a solução de bloqueio e trate as células por cinco minutos com 0,1 mililitros de peróxido de hidrogênio a 3% preparado em PBS 1X.
Novamente, lave as células duas vezes com 1X PBS e 1X com PBST. Adicionar 50 microlitros de anticorpo monoclonal anti-NS5A 9E10 por poço e incubar à temperatura ambiente durante uma hora. Lave os poços três vezes com 1X PBS e uma vez com PBST.
Adicionar 50 microlitros de HRP conjugado cabra anti-camundongo IgG secundária por poço, incubar por 30 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, remover o anticorpo não ligado lavando os poços com 0,1 mililitros de 1X PBS. Adicione 30 microlitros de DAB e incube a placa com balanço suave por 10 minutos à temperatura ambiente. Retire a solução DAB e lave os poços duas vezes com 1X PBS e uma vez com água destilada.
Adicionar 100 microlitros de PBS contendo azida de sódio a 0,03%. Examine cada poço sob um microscópio de luz invertida usando uma objetiva de 10X. Conte o número de poços positivos.
Use uma calculadora Reed e Muench para estimar a diluição do ponto final que infecta 50% dos poços. Dissolver o pibrentasvir, um inibidor da NS5A, em 100% de DMSO até uma concentração de um milimolar e diluí-lo em DMEM completo até uma concentração de 10 nanomolares. Em seguida, infecte células Huh-7.5 virgens a 70% de confluência com uma dose de vírus ML50 para infectar 50% das células por 12 horas e, em seguida, transfira as células infectadas para placas de seis poços 24 horas após a infecção.
Adicione 1X EC50 PIB às células infectadas após 16 horas de divisão celular. Faça isso depois que cada célula se dividir por seis passagens consecutivas, seguidas por três ciclos de passagem sem drogas, e monitore a disseminação do vírus usando um ensaio de formação de foco. Colha sobrenadantes virais em cada passagem e armazene a 80 graus Celsius negativos.
Extrair o RNA viral do sobrenadante no dia 18 e o cDNA sintetizado. Amplificar o gene NS5A usando cinco microlitros de cDNA diluído. Em seguida, determine as mutações de resistência à droga NS5A em seis a oito plasmídeos bacterianos positivos usando os primers de sequenciamento NS5A.
Bibliotecas completas de mutantes do genoma foram sintetizadas usando pJFH1 clonal em quantidades decrescentes de 100 a 10 nanogramas. Os rendimentos médios dos produtos de ep-PCR variaram de 3,8 a 12,5 nanogramas por microlitro. A proporção de mutações em bibliotecas mutantes aumentou com a diminuição da entrada de pJFH1 na reação de ep-PCR.
ML50 sintetizado usando 50 nanogramas do molde teve quatro substituições por 10.000 pares de bases copiados, enquanto ML25 sintetizado usando 25 nanogramas de molde abrigou nove substituições. Não foram encontradas substituições dentro do número de nucleotídeos sequenciados no pJFH1 clonal. As variantes virais ML50 foram menos suscetíveis ao pibrentasvir em comparação com o vírus clonal JFH1.
Dos oito clones NS5A, quatro apresentaram combinação de D7V+F28C, enquanto V8A+F28C e F36L ocorreram em um clone cada. Essas mutações estavam na região N terminal da NS5A, que é conhecida por abrigar mutações de resistência NS5A clinicamente relevantes. A concentração final de cada componente da ep-PCR é crítica, especialmente a quantidade de gabarito.
A falta de KB Extender reduzirá muito o rendimento do produto ep-PCR.
