A de técnicas automatizadas de microscopia eletrônica de seção serial. O passo limitante da taxa no pipeline levando à geração de modelos tridimensionais biológicos processamento de imagens. Nosso protocolo fornece uma diretriz passo-a-passo para produzir uma construção mais densa de volumes de imagem em apenas alguns dias.
Combinado com uma abordagem para medições quantitativas usando modelos tridimensionais. Com essa técnica, a estrutura 3D de tecidos, além do cérebro, pode potencialmente ser analisada para identificar prejuízos estruturais típicos de determinadas doenças e melhorar a estratégia de diagnóstico. Segmentação é um passo tedioso.
Aproveite para torná-lo o mais preciso possível para evitar revisar uma segmentação ruim e ter que reiniciar todo o processo. O design do software às vezes não é muito fácil de usar. Por isso, é importante ver o início dos trabalhos na segmentação.
Abra a pilha de imagens arrastando e soltando o arquivo nativo do microscópio contendo a pilha ou compre arrastando e soltando a pasta contendo toda a pilha de imagens na janela do software Uma vez que a pilha é aberta vá para a imagem, propriedades, para garantir que o tamanho dos voxels tenha sido lido a partir dos metadados. Transforme a imagem em 8 bits clicando em imagem, digite e selecione 8 bits. Se a pilha original for adquirida como diferentes telhas, aplique pontos dentro de TrakEM2.
Crie um novo projeto TrakEM2 usando novas, trakEM2 Usando funções incorporadas TrakEM2 estruturas de segmento de interesse, se necessário. Na gosmo do TrakEM2, clique com o botão direito do mouse'on anything'on na janela de modelo e selecione adicionar nova lista de área infantil'Arrastar e soltar qualquer coisa na pasta, sob objetos de projeto' e qualquer coisa apareceria lá. Arraste e solte, a lista de áreas do modelo para o que está localizado em objetos de projeto'No viewport de pilha de imagens, selecione o espaço Z com o cursor.
A lista de áreas aparecerá com o número de identificação exclusivo. Selecione a ferramenta brush na parte superior e use o mouse para segmentar uma estrutura preenchendo seu citosol sobre toda a pilha Z. Exportar a massa segmentada, a ser usada em Ilastik como semente para escultura.
Para isso, clique com o botão direito do mouse no objeto da lista de área na lista de espaço Z ou na máscara na porta de exibição e selecione a lista de exportação'area'como os rótulos T-I-F. Dependendo da resolução necessária para novas reconstruções, reduza o tamanho do pixel da pilha de imagens por amostragem. Considere os requisitos de memória do software que será utilizado para segmentação e reconstrução.
Ilastik lida com pilhas de até quinhentos pixels em X-Y. Leve-se em conta, o tamanho mínimo que os objetos ainda parecem reconhecíveis e, portanto, pode ser segmentado. Use o tamanho do ajuste da imagem Para melhorar o contraste e ajudar na segmentação, o filtro de máscara não-har pode ser aplicado para tornar as membranas mais nítidas.
Use o "filters'unharp mas" do processo'exporte a pilha de imagens como imagens únicas'para processamento adicional no software de segmentação, usando o formato 'save as'image sequence' do arquivo e escolha o formato TIFF' No gosoey Ilastik principal, selecione o módulo de escultura. Carregue a pilha de imagens, usando adicionar novo'e adicionar um único volume 3D/4D da sequência 'Selecione diretório inteiro' e escolha a pasta que contém a pilha de imagens salva como arquivos únicos'Na parte inferior a nova janela, onde as opções para carregar as imagens estão presentes, certifique-se de manter Z".
Para as etapas a seguir, todas as operações e botões podem ser encontrados no lado esquerdo do software principal. Na guia de pré-processamento, use as opções padrão já verificadas. Use filtros ricos de linhas brilhantes e mantenha a balança do filtro em 1.600.
Este perímetro pode ser modificado depois. Uma vez terminado o pré-processamento, selecione a próxima página no menu suspenso do módulo de rotulagem. Um objeto e um fundo estão presentes por padrão.
Selecione a semente do objeto clicando nela e desenhe uma linha em cima da estrutura de interesse. Em seguida, selecione a semente de fundo e desenhe uma ou várias linhas fora do objeto a ser reconstruída. Agora, clique no segmento e espere.
Dependendo da potência do computador e do tamanho da pilha, a segmentação pode levar de alguns segundos para horas. Uma vez feito, uma máscara semi-transparente destacando a segmentação deve aparecer em cima da estrutura segmentada. Role a pilha para verificar a segmentação.
A segmentação pode não ser precisa se não seguir a estrutura de interesse ou derramar a partir dela. Corrija qualquer derramamento colocando uma semente de fundo na segmentação derramada. E adicionar uma semente de objeto sobre o segmento não reconstruído do objeto de interesse.
A revisão visual precisa da segmentação com ilastik pode ser tediosa, mas é essencial garantir que os objetos exportados não contenham artefatos. Se a segmentação ainda não estiver correta, tente modificar com o parâmetro de viés que aumentará ou diminuirá a quantidade de pixels classificados incertos aceitos. Seu valor é 0,95 por padrão.
Diminua-o para limitar qualquer derramamento ou aumentar se a segmentação for muito conservadora. Outra possibilidade é clicar em pré-processamento e modificar o tamanho do filtro. Aumentar o valor minimizará os efeitos semelhantes ao ruído de sal e pimenta, mas também tornará as membranas mais borradas e detalhes menores mais difíceis de detectar.
Isso pode limitar a repercussão. Reitere o quanto necessário, desde que todos os objetos desejados tenham sido segmentados. Uma vez que um objeto esteja terminado, navegue até o segmento e clique em salvar o objeto atual'Duas novas sementes aparecerão para iniciar a segmentação de um novo objeto.
Medidas de superfície abstrata imediatamente como arquivos O-B-J clicando em exportar todas as malhas'Para visualizar modelos segmentados manualmente em 3D dentro do TrakEM2, lista de área de clique com o botão direito do clique e, em seguida, selecionar mostrar em 3D'A valor mais alto gerará uma malha de resolução mais baixa. Finalmente, exporte a malha 3D como WaveFront O-B-J', escolhendo entre as superfícies do arquivo de exportação do menu'WaveFront'Depois de instalar o kit de ferramentas de neurofofás, conforme descrito no protocolo de texto, abra o liquidificador. Importe os objetos usando a importação do lote neurofofálico clicando em importar objetos sob o menu da cena para importar vários objetos ao mesmo tempo.
Certifique-se de ativar, use re-malha e sombreamento liso. Selecione o objeto de interesse do out-liner e modifique a profundidade octree da função de re-malha sob o menu do modificador. Trabalhe iterativamente para minimizar o número de vértices e para evitar perder detalhes em resolução e morfologia correta.
Ao alterar a Profundidade Octree, a malha na gosmã principal mudará de acordo. Uma vez concluído, clique em solicitar para finalizar o processo. Navegue até o menu neurofofoco no painel esquerdo e use as interações de pilha de imagens da ferramenta de superposição de imagem para carregar a pilha de imagens.
Certifique-se de inserir o tamanho físico da pilha de imagens para X, Y e Z e selecione o caminho da pilha clicando na fonte Z.X e Y são planos ortogonais. Eles são opcionais e serão carregados somente se o usuário inserir o caminho válido. Em seguida, selecione uma malha na porta de exibição clicando com o botão direito do mouse nela.
Digite o modo de edição pressionando a guia, selecione um ou mais vértices usando o mouse com o botão direito do mouse e, finalmente, clique em mostrar imagem no vértice. Um ou mais planos cortados com o micrografo aparecerão sobrepostos em cima da malha. Selecione o plano de corte clicando com o botão direito do mouse nele.
Em seguida, pressione o controle Y e role sobre o modelo 3D usando o pergaminho do mouse. Isso também pode ser usado como método de revisão. Mostrado aqui é a segmentação e reconstrução usando TrakEM2 e Ilastik.
O gosmo TrakEM2 é mostrado com objetos segmentados manualmente em vermelho. A máscara exportada pode então ser usada como entrada para segmentação semi-automatizada. A partir de Ilastik, as máscaras podem ser exportadas para o TrakEM2 para revisão manual.
Máscaras podem ser exportadas como malhas triangulares 3D para revelar estruturas reconstruídas. Neste exemplo, quatro neurônios, astrócitos, microglia e periciosos foram reconstruídos utilizando esse processo. Uma análise 3D de morfologias reconstruídas usando ferramentas personalizadas é mostrada.
Aqui está um volume de imagem isotrópico de um conjunto de dados de microscopia eletrônica focalizado. Uma reconstrução densa desses dados revela axônios, o processo astrócito e dendritos. Este micrografo mostra exemplos de alvos para quantificações como sinapses e grânulos de glicogênio astrócito.
A máscara desse micrografo mostra a distribuição de grânulos de glicogênio em torno de sinapses. Mostrado aqui é uma ilustração gráfica da entrada e saída da visualização gráfica do modelo de absorção de lactato derivado de glicogênio ou GLAM'Aqui, um usuário é mostrado usando uma realidade virtual ou fone de ouvido V-R enquanto trabalha na reconstrução densa a partir de um conjunto de dados de microscopia eletrônica de íons focado. A partir de um subconjunto de neurites, uma cena V-R imersiva pode ser observada.
O laser verde está apontando para um pico glam.. é de importância primária, pois determina o tamanho correto dos objetos 3D exportados e determina que suas medidas refletem seu tamanho real. O conceito de imagem de seção serial, segmentação de imagens e construção 3D é bastante antigo.
Descobrir a aceleração técnica está levando a avanços nas colectomias na revisão dos livros de anatomia. Embora o método tenha sido desenvolvido para pesquisa cerebral em microscopia eletrônica, ele pode ser generalizado para qualquer técnica de microscopia gerando dados Além disso, qualquer tipo de técnica de imagem 3D pode se beneficiar de tais técnicas de segmentação e construção de imagens. Incluindo tomografias e M-R-I.
