Os astrócitos são uma população autógena interessante para atingir a programação neuronal direta. Este protocolo fornece uma técnica confiável para isolar a cultura astrócitos com alta pureza de diferentes regiões ou do sistema nervoso central. Este protocolo é projetado e otimizado para investigar a capacidade dos astrócitos de serem reprogramados em neurônios funcionais sem confundir fatores como diferenças na pureza dos astrócitos de diferentes populações de startups.
Demonstrar que o procedimento será feito por Bob Hersbach, Pós-doutor no laboratório, e Tatiana Simon uma assistência técnica em nosso laboratório. Para começar, coloque o tronco de um rato eutanizado em uma placa de Petri de 35 milímetros e mantenha-o no gelo. Abra a pele com uma tesoura e remova a vértebra com uma tesoura pequena.
Em seguida, extraia a medula espinhal e coloque-a em um tampão de dissecção no gelo. Sob um microscópio de dissecção estereotática com duas vezes ampliação, remova as meninges das medulas espinhais isoladas usando fórceps e transferiu tecido medular dissecado e limpo para um tubo C. Adicione 50 microliters de enzima P do kit de dissociação do tecido neural e 30 microliters de mistura de enzima previamente preparada a cada tubo C.
Inverta os tubos C e coloque-os em uma dissociada aquecida garantindo que todo o tecido seja coletado na tampa do tubo. Ilufra as células removendo a coluna do separador adicionando 800 microlitadores do meio de cultura astrócito e empurrando células para fora da coluna com o êmbolo incluído. Células de placa nos frascos de cultura previamente preparados adicionando 4,2 mililitros de cultura de astrócitos complementados com 10 nanogramas por mililitros de EGF e bFGF.
Não é necessário revestir os frascos de cultura para astrócitos isolados de outras regiões cerebrais, mas fornece um substrato melhor para astrócitos isolados da medula espinhal. Cultura as células a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono. Realize assentos de astrócito sob um armário de segurança biológica com um nível de segurança um e prepare 24 placas de poço com deslizamentos de tampa de vidro revestidos de Poli-D-Lysine, conforme descrito no manuscrito do texto.
Para o revestimento, isolar seis medulas espinhais de camundongos P2 produz cerca de 1 milhão de células. Aspirar mídia dos frascos de cultura T-12.5 contendo os astrócitos cultivados e lavar uma vez com 1x PBS. Retire os astrócitos do frasco de cultura adicionando 0,5 mililitros de 0,05% de trippsina EDTA e incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos.
Toque suavemente na lateral do frasco para liberar células da superfície do frasco de cultura e verifique o desprendimento sob um microscópio de campo brilhante usando uma ampliação de 10 vezes. Pare a tripinazação com 2,5 mililitros de cultura astrócito média e colete suspensão celular em tubos de 15 mililitros. Centrífuga a 300 RCF por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Aspirar supernacia e resobender células em um mililitro de meio de cultura astrócito. Calcule a concentração celular usando um hemócito ou um sistema automatizado de contagem de células. Com base no número de células, diluir a suspensão celular com meio de astrócito fresco suplementado com EGF e bFGF a 10 nanogramas por mililitro por fator.
Adicione 500 microliters da suspensão celular a cada poço das 24 placas de poço previamente preparadas e células de cultura a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Prepare o meio de diferenciação neuronal adicionando um suplemento B27 mililitro a 49 mililitros de meio de cultura básica. Após 24 a 48 horas, dependendo se as células foram transduzidas ou transfepultadas, substitua o meio de astrócito por um mililitro de diferenciação neuronal por poço.
Cultume as células a 37 graus Celsius com 9% de dióxido de carbono. Para aumentar a eficiência da reprogramação, suplementar o meio de diferenciação neuronal com forskolina e dorsomorfina a uma concentração final de 30 micromolares e um micromolar, respectivamente, ao substituir o meio de astrócito pelo meio de diferenciação. Ao optar por tratar células com forskolina e dorsomorphina fornecem uma segunda dose de dorsomorphina dois dias após o tratamento inicial.
Adicione este segundo tratamento diretamente ao meio da cultura. As culturas primárias dos astrócitos atingiram 80 a 90% de confluência entre sete a dez dias após a triagem e o revestimento de células assistidas magnéticas. No dia seguinte ao revestimento, as células tipicamente cobriam de 50 a 60% da superfície de deslizamento de cobertura.
As culturas consistiam principalmente de astrócitos nesta fase, enquanto outros tipos de células, como explosões neurológicas, estavam praticamente ausentes. Aos sete dias após a transdução ou transfecção, as células neuronais induzidas eram claramente distinguíveis dos astrócitos. A soma da célula neuronal era menor do que os astrocitos não programados tinham processos longos e era positivo para marcador neuronal, beta três tubulin, e negativo para marcador de astrócito GFAP.
Aos 21 dias após a transdução ou transfecção, muitos neurônios induzidos eram capazes de disparar potenciais de ação e eram positivos para o marcador neuronal maduro NeuN e a proteína sináptica pan Synaptophysin. É essencial dissecar adequadamente a região de interesse. Evitando contaminação do tecido circundante.
Deve-se tomar cuidado para remover as meninges e a gânglio raiz dorso da medula espinhal isolada. Este método pode ser usado para isolar astrócitos de várias regiões do sistema nervoso central, incluindo o córtex cerebral, o cérebro dorsal e o cerebelo. No futuro, essa técnica nos permitirá expandir nossos conhecimentos sobre astrócitos regionais e seu potencial de ser reprogramado em neurônios funcionais.
