Gostaríamos de agradecer Michael Feyder e Terrell Holloway por sua assistência durante a configuração inicial da técnica e laboratório do Dr. Fumi Ono s para o acesso ao seu microscópio confocal. Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto Nacional de Saúde através do programa intramural da NIAAA e NINDS.

1. Preparando DII / Tungsten Bullets Bead: DII (1-1&#39;-Dioctadecyl-3, 3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perclorato) balas devem ser preparadas com antecedência de cortar fatias de cérebro. O procedimento demora cerca de 2-4 horas, dependendo de quantas balas são preparados de uma só vez. <ol><li> Se a partir de um novo lote de contas de tungstênio, prepare alíquotas de 300 mg cada. Alíquotas são preparados através da suspensão de 6 gramas de tungstênio em 2 ml de cloreto de metileno. Então, pipetar 100 ml de solução em tubos de microcentrífuga talão para produzir alíquotas de 300 esferas de tungstênio mg alíquotas Conservar à temperatura ambiente (Nota: o cloreto de metileno evapora muito rapidamente álcool também pode ser usado minimizar a evaporação).... </li><li> Quando a partir de alíquotas de contas, ressuspender cada alíquota (300 esferas de tungstênio mg) em 300 ml de cloreto de metileno e cobrir rapidamente para evitar a evaporação. Esta quantidade é suficiente para 3 lotes de balas. </li><li> Preparar a solução corante, pesando 13,5 mg de DII corante lipofílico e adicionando 450 mL de cloreto de metileno (concentração final = 3mg/100μl). </li><li> Brasão as contas com corante. Coloque uma lâmina de vidro em um pedaço de cera revestido de papel e pesar Pipetar 100 mL de contas para o slide. Adicione 100 ml de solução DII, misturar bem usando pipeta ponta, e ar seco, até virar cinza contas de luz. </li><li> Use uma lâmina para raspar contas fora da lâmina de vidro e corte as contas em um pó fino (Nota: use uma lâmina nova, se fazendo mais de uma cor de balas de modo a não contaminar os corantes).. </li><li> Contas de raspar para o pesar contas de papel e funil para um tubo de 15 ml. Adicionar 3 ml de água e sonicado em banho-maria por 10-30 minutos em temperatura ambiente (Nota: cortar o pó e sonicação são aplicadas para minimizar a formação de aglomerados de grânulos revestidos que pode atrapalhar a rotulagem esparsos de neurônios individuais).. </li></ol> 2. Preparar solução de polivinilpirrolidona (PVP) e tubos: Para melhorar a penhora de contas para a tubulação de bala (tubulação TEZFEL), bata-a com polivinilpirrolidona solução (PVP). <ol><li> Prepare 10 ml de solução de PVP em água a uma concentração de 10 mg PVP / ml. </li><li> Use uma seringa de 12 ml com adaptador de tubo (tubo flexível com diâmetro ligeiramente maior) para passar a solução PVP através do tubo de bala e, em seguida, expulsá-lo do outro lado. Reutilização solução para tubo de revestimento mais bala se vários lotes são preparados simultaneamente. Descartar PVP solução após o uso. </li><li> Para adicionar as contas para o tubo vortex bala, as contas para produzir uma solução homogênea e usar a seringa para puxar a solução talão através do tubo de forma que contas são distribuídas uniformemente pela tubulação. ((Nota:) tentam minimizar o número de bolhas de ar na tubulação). </li><li> Alimentar o tubo através da estação de preparação e permitir que as contas para resolver. Use a seringa para remover suavemente a água de modo que somente as contas permanecem. </li><li> Girar a tubulação na estação de preparação e seque com gás nitrogênio até as gotas de água não são mais visíveis. Esta etapa irá demorar cerca de 10-20 min. </li><li> Cortar balas com cortador de tubos em 13 mm e comprimentos lugar em frascos de cintilação contendo Drierite ou algum tipo de sulfato de cálcio anidro. Embrulhe em uma folha de frascos para proteger da luz. </li></ol> 3. Coloração DII: Esta técnica rotulagem pode ser usado para manchar neurônios no tecido cerebral de diversas espécies, neste caso particular, a partir do mouse (3-6 meses de idade) e primatas não-humanos (9-15 anos). É preferível que as fatias são preparados a partir de tecido cerebral fixa obtidos por perfusão intracardíaca de solução de fixador, pois a preservação de tecido deve ser melhor nessa condição. No entanto, a fixação por perfusão nem sempre é viável (como foi o caso com o tecido macaco) e rotulagem DiOLISTIC ainda pode ser aplicado com sucesso em diferentes procedimentos de preparo de tecidos. Aqui nós descrevemos três procedimentos diferentes para a preparação do tecido: <ol class="lalpha"><li> Fix cérebro por perfusão intracardíaca → remover cérebro → postfix por 10 min → fatia cortada mancha → </li><li> Remover cérebro → bloco de corte de tecido → bloco corrigir → lavar em PBS fatia corte → → mancha </li><li> Remover cérebro → fatias cortadas → corrigir → lavar → mancha </li></ol> No presente estudo, os cérebros de macacos foram obtidas de indivíduos que foram transcardially perfundidos com líquido gelado cerebral artificial espinhal (ACSF) antes da colheita do cérebro e um bloco (4 mm de espessura) de tecido que contém o núcleo caudado umnd putâmen foi fixado por 60 min em temperatura ambiente. Para todos os procedimentos, a solução fixadora contém paraformaldeído a 4% de sacarose e 4% em PBS (preparada fresca ou utilizados dentro de 15 dias). É importante notar que os tempos de fixação são cruciais para a coloração bem sucedida. Overfixation pode afetar a coloração por perturbar a integridade da membrana plasmática e causando o vazamento de corante para fora da célula (veja mais informações em resultados). <ol><li> Para o procedimento a e b, fatias (200μm) são cortadas a partir do cérebro fixo ou bloco de tecido e fatias colocado em 24 poços da placa com PBS. Para o procedimento c, fresco fatias cerebral aguda (200 mm) são cortados com uma vibratome em solução corte a frio contendo (em mM) 110 Colina Cl-, 25 de NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 2,5 KCl, 0,5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 25 de glicose, 11,6 ácido ascórbico, ácido pirúvico 3,1 (osmolaridade = 310 mOsmols) e imediatamente após as fatias são colocadas em placas de 24 poços e fixado em 30 min com solução fixadora à temperatura ambiente. </li><li> Lave as fatias com PBS, três vezes. </li><li> Antes de fatias de tiro, retire a PBS dos poços e, usando um pincel, coloque a fatia no centro do poço. </li><li> Atirar balas DII até 3.0 M de papel de filtro usando um sistema de Helios Gene Gun em 120-180 a pressão do gás hélio psi, colocando a arma a uma distância de 1,5 cm entre a amostra ea ponta do cano. (Nota importante:. Neurônios Somente dentro de 50 mm da superfície fatia será marcado por este método por isso é importante para manter o mesmo lado da fatia voltada para cima durante a lavagem e para a montagem Desta forma, você irá certificar-se que o neurônios rotuladas será dentro da distância focal, quando de imagem com um microscópio confocal). </li><li> Lave as fatias com PBS três vezes e armazená-los em PBS durante várias horas para permitir que a DII a se espalhar ao longo dos dendritos. </li><li> Monte fatias numa lâmina de vidro com Prolongar Antifade Ouro e cubra com uma lamela 18X18 milímetros No.1. (Nota: para c processo, o melhor é montar fatias no mesmo dia em que a integridade das fatias não é bem conservado durante a noite). </li><li> Seal com unhas polonês claro depois meios de montagem secou. </li><li> Alternativamente, as fatias podem ser marcadas com anticorpos antes da montagem, conforme descrito abaixo. (Nota: Slides pode ser usado pelo menos 6 meses a um ano se armazenado no escuro a 4 ° C. DII é a exposição sensível e longo prazo luz à luz fará com que a mancha a desvanecer-se). </li></ol> 4. Coloração de anticorpos: A imunocoloração deve ser realizada após o passo 3.4 e antes da montagem. <ol><li> Permeabilização: fatias Incubar em 0,01% Triton X-100 em solução de PBS por 15 min em temperatura ambiente (300-500 mL por poço). NOTA: Não use maiores concentrações de detergente, pois isso irá dissolver DII e reduzir significativamente a coloração fluorescente. Tentar minimizar o tempo em detergente como incubações extensiva também irá reduzir a rotulagem DII. Se incubações estendida são necessárias, manter fatias em PBS, e não em solução de bloqueio. </li><li> Bloqueio: fatias Incubar em solução de bloqueio contendo soro de cabra 10%, 0,01% Triton X-100 em PBS por 30 min em temperatura ambiente. </li><li> Anticorpo primário: Adicionar anticorpo na diluição desejada em solução de bloqueio (por exemplo, coelho anticorpo anti-GFP em 1:1000 diluição). Adicionar 300-500 mL por poço e incubar por 1-2 hrs. (Nota: se incubações durante a noite são necessárias, retire o detergente do solução de bloqueio). </li><li> Lave as fatias com PBS por 5 - 15 min, 3 vezes. </li><li> Anticorpo secundário: Incubar com anticorpo secundário por 30 min em temperatura ambiente. Prepare a solução de anticorpo secundário na diluição desejada em solução de bloqueio (por exemplo, Alexa Fluor 488-anticorpo conjugado na diluição 1:1.000). </li><li> Lave as fatias com PBS por 5-15 min, 4 vezes. </li><li> Monte fatias de slides com Prolongar Antifade Ouro e cubra com uma 18x18 milímetros No.1 lamela. Seal com unha polonês após meios de montagem secou. </li></ol> 5. Resultados representativos: <ol><li> Verificação de rotulagem correta: Seção podem ser visualizados em um escopo fluorescentes dissecar equipado com uma lâmpada de mercúrio e fluorescentes cubo vermelho filtro para confirmar rotulagem DiOLISTIC sucesso. A Figura 1 mostra imagens exemplar de secções cerebrais muito bem marcado obtidas com pequeno aumento. Duas características importantes estão a olhar para um padrão de rotulagem esparsos (Figura 1A) e a capacidade de identificar individualmente os componentes celulares (Figura 1B-C). </li&gt; <li> Solução de problemas de rotulagem DiOLISTIC: Figura 2 mostra exemplos de seções em que a rotulagem DiOLISTIC trabalhou de forma incorreta. Em nossa experiência, existem três causas principais para a rotulagem ineficiente: <ul><li> Rotulagem é muito esparsa ou densa: Muito poucas células são rotulados por seção em um caso ou muitas células são rotulados impedindo o isolamento e estudo de elementos celulares única. Solução: ajustar a concentração de grânulos com revestimento na solução final utilizada para o revestimento da tubulação bala TEFZEL (seção 1.6). Diminuir ou aumentar o volume de água (3 ml valor inicial) utilizado para dissolver as contas em ordem para corrigir a rotulagem demasiado escassa ou muito densa, respectivamente. Além disso, baixa eficiência de rotulagem podem ser causados ​​por menos de pressão do gás ideal para fotografar as contas revestido em seções. Esta possibilidade pode ser descartada, certificando-se que a tubulação de bala TEFZEL lançou a maior parte dos grânulos revestidos e parece claro após o disparo. Caso contrário, a pressão do gás para a fotografia deve ser aumentada. </li><li> Balas ruins: as grandes aglomerações ou clusters de contas corante revestido de tungstênio são formadas durante a preparação de bala. Seções se assemelhará exemplos na Figura 2A-B. Solução: fazer novas balas com especial atenção o ponto 1.5 e / ou prolongar o tempo de sonicação no ponto 1.6. </li><li> Prazo de fixação: o tecido é mantido em solução de paraformaldeído por mais tempo do que o tempo ideal necessário para a fixação (30 minutos para seções 200-300 mM, 1 hora para 4 seções mm). Isso compromete a integridade da membrana plasmática e produz seções rotuladas que se parecem com aqueles mostrados na Figura 2C-D em que a rotulagem parece fora de foco devido à dispersão de corante para fora das células. Solução: reduzir o tempo de fixação. </li></ul></li><li> Imagem confocal: pilhas de imagens são adquiridas através de um microscópio confocal (Zeiss LSM 510 META) com um objetivo de 20x para a célula inteira e objetiva de imersão 63x de água para os segmentos de dendrite. DII estava animado usando uma linha de laser 561 DPS nm e fluorescência verde do anticorpo secundário foi animado usando uma linha de laser 488 nm. A secção óptica da amostra rotulada alcançado quando usando microscopia confocal permite ainda para o isolamento de células marcadas única na amostra. Figura 3A mostra um neurônio estriatal spiny médio do cérebro do rato e seu padrão de ramificação complexa dendrite. Imagens de alta ampliação de ramos dendrite desses neurônios a partir de roedores (Figura 3B) e primatas não-humanos (Figura 3C) demonstram o grau de coloração em dendritos e espinhas dendríticas usando esta técnica em ambas as espécies. Dendritos e suas saliências (espinhas) aparecem bem definidos, mesmo quando se considera a coluna, longo e fino cabeças tão abundante nos neurônios espinhosos médios. Ao combinar DiOLISTICS com imunomarcação, imagem confocal também é útil para localizar a mancha de forma inequívoca para o mesmo plano focal e mesma célula. A Figura 4 mostra um exemplo de co-localização de DII rotulagem e imunomarcação para GFP em uma única célula. A imagem é uma pilha (0,7 mM z-seção) obtido a partir de uma fatia estriatal de um camundongo transgênico expressando a proteína fluorescente GFP sob o promotor receptor D1 de dopamina. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. DII rotulagem de neurônios em fatias de cérebro de primatas não-humanos. (A) imagem de baixa ampliação de uma fatia do cérebro manchada contendo o núcleo caudado de um macaco cynomolgus que mostra escassa rotulagem de neurônios com DII. (BC) neurônios isolados spiny meio pode ser facilmente identificado usando um escopo fluorescentes de dissecação. <img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Rotulagem DiOLISTIC Resolução de Problemas. (AB) fatias de estriado dorsal Stained de macaco (A) e mouse (B) mostrando grandes aglomerações de corante revestido contas e, como conseqüência, não há elementos individuais de celular podem ser distinguidos. (CD) Imagens que exemplificam o resultado da aplicação DiOLISTIC rotulagem para as seções que foram mantidos em solução fixadora por períodos prolongados de tempo, ou quando a preservação de tecido falhou em macaco (C) e tecido mouse (D). <img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Confocal imagem de estriatal médio spiny neurônio corados com DII. (A), pilha de Imagem de uma célula inteira permite a análise morfológica dos ramos dendríticas. Segmentos (BC) Dendrite de mouse (B) e macaco (C) neurônios espinhosos médios mostram uma rotulagem clara de dendrite e espinhas. <img src="/files/ftp_upload/2081/2081fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Combinando rotulagem DiOLISTIC com imunocoloração. (A) Dii rotulados <strong&gt; médio spiny neurônio do estriado de BAC GFP camundongo transgênico expressando sob o promotor receptor D1 de dopamina. imunocoloração (B) usando anticorpos anti-GFP, como descrito por métodos adaptados de Lee et al. (2006). Mesmo campo como A. imagem (C) composto de vermelho e de fluorescência verde identifica neurônio DII marcado como um neurônio GFP-positivo.

<ol>
	<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+"DiOLISTIC"+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor "DiOLISTIC" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system.">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harb Protoc. , pdb.prot5202-pdb.prot5202 (2009).</li><li>Grutzendler, J., Tsai, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+labeling+of+neuronal+populations+by+ballistic+delivery+of+fluorescent+dyes.">Rapid labeling of neuronal populations by ballistic delivery of fluorescent dyes.</a> Methods. 30, 79-85 (2003).</li><li>Lee, K. W., Kim, Y., Kim, A. M., Helmin, K., Nairn, A. C., Greengard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocaine-induced+dendritic+spine+formation+in+D1+and+D2+dopamine+receptor-containing+medium+spiny+neurons+in+nucleus+accumbens.">Cocaine-induced dendritic spine formation in D1 and D2 dopamine receptor-containing medium spiny neurons in nucleus accumbens.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 3399-3404 (2006).</li><li>Matsubayashi, Y., Iwai, L., Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+double-labeling+with+carbocyanine+neuronal+tracing+and+immunohistochemistry+using+a+cholesterol-specific+detergent+digitonin.">Fluorescent double-labeling with carbocyanine neuronal tracing and immunohistochemistry using a cholesterol-specific detergent digitonin.</a> J Neurosci Methods. 174, 71-81 (2008).</li><li>Neely, S. t. a. n. w. o. o. d., Deutch, G. D., Y, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+diOlistic+labeling+with+retrograde+tract+tracing+and+immunohistochemistry.">Combination of diOlistic labeling with retrograde tract tracing and immunohistochemistry.</a> J Neurosci Methods. 184, 332-336 (2009).</li><li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diolistics:+incorporating+fluorescent+dyes+into+biological+samples+using+a+gene+gun.">Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun.</a> Trends Biotechnol. 25, 530-534 (2007).</li><li>Shen, H. W., Toda, S., Moussawi, K., Bouknight, A., Zahm, D. S., Kalivas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+dendritic+spine+plasticity+in+cocaine-+withdrawn+rats.">Altered dendritic spine plasticity in cocaine- withdrawn rats.</a> J. Neurosci. 29, 2876-2884 (2009).</li></ol>

Todos os procedimentos foram realizados em animais a seguir a orientação do Animal Care e do Comitê Use a NIAAA eo Oregon National Primate Research Center. Os autores não têm nada a revelar.

Rotulagem DiOLISTIC é uma das técnicas mais versáteis disponíveis para as células fluorescente rotulagem, porque pode ser aplicado a seções de tecido de diversas espécies, para uma ampla gama de idades, e para o tecido obtido frescos ou de fixador-perfundidos animais (ver também Gan et al ., 2009). O processo é relativamente rápido, uma vez que leva 1-2 dias e pode ser combinada com outras abordagens rotulagem mais clássicos, como imunocoloração (Lee et al., 2006). Atenção especial deve ser dada para evitar o excesso de fixação e uso de detergente de alta concentração em soluções de incubação porque estes compreendem a integridade da membrana lipofílica e fazer com que o corante vazar para fora das células. Penetração de anticorpos pode ser facilitado por baixas concentrações de Triton X-100 (Lee et al., 2006), bem como digitonina ou saponina na solução de incubação (Matsubayashi et al., 2008). Algumas modificações que podem ser aplicadas para esta técnica incluem o uso de balas com diversas tinturas e, como descrito por Gan et al. (2000) ou mudar o tamanho e tipo de exposição de anticorpos (Neely et al., 2009). Tradicionalmente, a DII tem sido usado para traçar projeções neuronais no cérebro. Rotulagem DiOLISTIC amplia sua aplicação, descrevendo um método útil para analisar a morfologia das células. Morfologia neuronal é de grande interesse por causa da grande diversidade encontrada no cérebro e as especulações de que a forma da célula pode refletir sobre a multiplicidade função de populações neuronais no sistema nervoso. Um exemplo disso é o fato de que muitos neurônios do sistema nervoso protrusão mostrar mamíferos pequenos chamadas espinhas dendríticas, que são o local das sinapses glutamatérgicas. Desta forma, a densidade de sinapses glutamatérgicas em uma célula pode ser correlacionada com a densidade de espinhas dendríticas, que pode ser medido utilizando a técnica de rotulagem descritos neste documento. Além disso, outros parâmetros morfológicos, tais como comprimento total dendrite, padrão de ramificação, forma espinha dendrítica e densidade podem ser quantificados e estudados. O uso de marcação fluorescente para estudar a morfologia neuronal tem muitas vantagens quando comparado com técnicas mais tradicionais que dependem de microscopia de campo claro (por exemplo, a coloração de Golgi), pois permite maior resolução de imagem confocal. Outra vantagem de usar DII como um fluoróforo em experimentos destinados a medir a densidade espinha dendrítica e morfologia é suas propriedades lipofílicas. Partições DII na membrana plasmática e proporciona um contorno bem definido dos processos neuronais e saliências dendríticas. Dado o pequeno volume de mais espinhas dendríticas (menos de 1 femtoliter), coloração da membrana é mais eficiente e permite uma melhor visualização de pequenas saliências finas de coloração citoplasmática.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1-1&#x2019;-dioctadecyl-3,3,3&#x2019;,3&#x2019;- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D-282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methylene chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
<td>H485-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tungsten beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2269</td>
<td>1.7 &mu;m diameter</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyvinylpyrrolidone </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>529504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tefzel bullet tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2441</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing cutter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2422</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helios Gene Gun</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2431</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isopore membrane filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>TSTP02500</td>
<td>3.0 &mu;m pore size</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold Antifade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alfa Aesar</td>
<td>30525-89-4</td>
<td>(16% w/v)</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

diolistic labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices

Coloração DiOLISTIC usa a arma gene para introduzir corantes fluorescentes, como o DII, em neurônios de fatias do cérebro (Gan et al, 2009;. O&#39;Brien e Lummis, 2007; Gan et al, 2000).. Aqui nós fornecemos uma descrição detalhada de cada etapa necessária em conjunto com imagens exemplares de resultados bons e ruins que ajudarão ao configurar a técnica. Em nossa experiência, a poucos passos mostrou crítico para o sucesso da aplicação DiOLISTICS. Estas considerações incluem a qualidade das balas revestidas de DII, o grau de exposição fixador, ea concentração de detergente utilizado nas soluções de incubação. Dicas e soluções para problemas comuns são fornecidos. Esta é uma técnica rotulagem versátil que pode ser aplicado a várias espécies de animais em uma ampla gama de idades. Ao contrário de outras técnicas de rotulagem fluorescentes que são limitados para a preparação de animais jovens ou restrita a camundongos, porque eles contam com a expressão de um transgene fluorescentes, rotulagem DiOLISTIC pode ser aplicado a animais de todas as idades, espécies e genótipos e pode ser usado em combinação com imunocoloração para identificar uma sub-população específica de células. Aqui nós demonstrar o uso de DiOLISTICS aos neurônios etiqueta em fatias de cérebro de camundongos adultos e adultos primatas não-humanos com o objetivo de quantificar dendrite ramificação e morfologia espinha dendrítica.

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DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Nós demonstramos o uso da arma para introduzir gene corantes fluorescentes, como DII, em neurônios em fatias de cérebro de roedores e primatas não-humanos de diferentes idades. Neste caso particular, nós usamos camundongos adultos (3-6 meses de idade) e adultos macacos cynomologus (9-15 anos). Esta técnica, descrita originalmente pelo laboratório do Dr. Lichtman (Gan<em&gt; Et al</em&gt;., 2000), é bem adequado para o estudo da ramificação dendríticas e morfologia da coluna dendríticas e pode ser combinado com imunocoloração tradicional, se os detergentes são mantidas a uma baixa concentração.

Labeling DiOLISTIC de Neurônios de roedores e não-humanos fatias do cérebro do primata

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

diolistic-labeling-neurons-from-rodent-non-human-primate-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.8K visualizações.  NIH. Nós demonstramos o uso da arma para introduzir gene corantes fluorescentes, como DII, em neurônios em fatias de cérebro de roedores e primatas não-humanos de diferentes idades. Neste caso particular, nós usamos camundongos adultos (3-6 meses de idade) e adultos macacos cynomologus (9-15 anos). Esta técnica, descrita originalmente pelo laboratório do Dr. Lichtman (Gan Et al., 2000), é bem adequado para o estudo da ramificação dendríticas e morfolo...

Vídeo: DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation de neurônios de fatias do cérebro de roedores para estudar a transmissão sináptica e Imagem Terminais pré-sináptica

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Neurociência

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Respostas de imagem de cálcio nos neurônios GFP-tagged fatias de cérebro de rato Hipotalâmicos

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Tensão sensível Gravação Dye de axônios, dendritos e espinhas dendríticas de neurônios individuais em fatias de cérebro

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the adult brain. However, the mechanisms these normally quiescent cells employ to ensure proper functioning of neural networks, as well as their role in recovery from injury and mitigation of neurodegenerative processes are little understood. These cells reside in regions referred to as &#34;niches&#34; that provide a sustaining environment involving modulatory signals from both the vascular and immune systems. The isolation, maintenance, and differentiation of CNS SCs under defined culture conditions which exclude unknown factors, makes them accessible to treatment by pharmacological or genetic means, thus providing insight into their in vivo behavior. Here we offer detailed information on the methods for generating cultures of CNS SCs from distinct regions of the adult brain and approaches to assess their differentiation potential into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. This technique yields a homogeneous cell population as a monolayer culture that can be visualized to study individual SCs and their progeny. Furthermore, it can be applied across different animal model systems and clinical samples, being used previously to predict regenerative responses in the damaged adult nervous system.

Neural stem cells harvested from the adult brain are increasing utilized in applications ranging from the basic research of nervous system development to exploring potential clinical applications in regenerative medicine. This makes rigorous control in the isolation and culturing conditions used to grow these cells critical to sound experimental outcomes.

Crescer a partir de células-tronco neurais convencionais e não convencionais Regiões do cérebro adulto de roedores

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Preparação do Tecido Cerebral primata não humano para Pré-incorporação de imuno-histoquímica e Microscopia Electrónica

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a challenging and low-throughput technique due to its complexity and high reliance on user operation and control. This manuscript demonstrates an image-guided automatic patch clamp system for in vitro whole-cell patch clamp experiments in acute brain slices. Our system implements a computer vision-based algorithm to detect fluorescently labeled cells and to target them for fully automatic patching using a micromanipulator and internal pipette pressure control. The entire process is highly automated, with minimal requirements for human intervention. Real-time experimental information, including electrical resistance and internal pipette pressure, are documented electronically for future analysis and for optimization to different cell types. Although our system is described in the context of acute brain slice recordings, it can also be applied to the automated image-guided patch clamp of dissociated neurons, organotypic slice cultures, and other non-neuronal cell types.

This protocol describes how to conduct automatic image-guided patch-clamp experiments using a system recently developed for standard in vitro electrophysiology equipment.

Aplicação de correia de patch automatizada com guia de imagem para estudo de neurônios em fatias de cérebro

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

Avaliação da densidade de sinapse em fatias Hippocampal cérebro de roedor

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Isolamento e extração de RNA de neurônios, macrófagos e Microglia de Zebrafish Larval cérebros

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) is a promising approach when pharmacological treatment fails or neurosurgery is not recommended. Acute brain slices coupled to microelectrode arrays (MEAs) represent a valuable tool to study neuronal network interactions and their modulation by electrical stimulation. As compared to conventional extracellular recording techniques, they provide the added advantages of a greater number of observation points and a known inter-electrode distance, which allow studying the propagation path and speed of electrophysiological signals. However, tissue oxygenation may be greatly impaired during MEA recording, requiring a high perfusion rate, which comes at the cost of decreased signal-to-noise ratio and higher oscillations in the experimental temperature. Electrical stimulation further stresses the brain tissue, making it difficult to pursue prolonged recording/stimulation epochs. Moreover, electrical modulation of brain slice activity needs to target specific structures/pathways within the brain slice, requiring that electrode mapping be easily and quickly performed live during the experiment. Here, we illustrate how to perform the recording and electrical modulation of 4-aminopyridine (4AP)-induced epileptiform activity in rodent brain slices using planar MEAs. We show that the brain tissue obtained from mice outperforms rat brain tissue and is thus better suited for MEA experiments. This protocol guarantees the generation and maintenance of a stable epileptiform pattern that faithfully reproduces the electrophysiological features observed with conventional field potential recording, persists for several hours, and outlasts sustained electrical stimulation for prolonged epochs. Tissue viability throughout the experiment is achieved thanks to the use of a small-volume custom recording chamber allowing for laminar flow and quick solution exchange even at low (1 mL/min) perfusion rates. Quick MEA mapping for real-time monitoring and selection of stimulating electrodes is performed by a custom graphic user interface (GUI).

We illustrate how to perform recording and electrical modulation of 4-aminopyridine-induced epileptiform activity in rodent brain slices using microelectrode arrays. A custom recording chamber maintains tissue viability throughout prolonged experimental sessions. Live electrode mapping and selection of stimulating pairs are performed by a custom graphical user interface.

Gravação e modulação da atividade epileptiforme em fatias de cérebro de roedor acoplado para matrizes de microeletrodos

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...