Implantes de cartilagem representam um método translacional de fácil acesso para interrogar a remodelação tecidual na matriz da cartilagem. O método pode fornecer uma visão precoce de como os potenciais novos tratamentos afetam a estrutura articular. A principal vantagem dessa técnica é que essa cartilagem permanece em um ambiente 3D nativo, que permite o perfil da interação entre as células e a matriz circundante usando biomarcadores.
O princípio no método não é exclusivo da cartilagem. Explantas podem ser extraídas de outros tecidos, como ovium, fígado e pulmão e interrogadas usando biomarcadores derivados de matriz. Demonstrando o procedimento será Amalie Engstrom, uma estudante de pós-graduação do nosso laboratório.
Realize todo o processo de fornecimento de tecido fora de uma coifa de fluxo laminar em um ambiente asséptico. De um matadouro local, obtenha uma articulação de joelho femoral bovina bovina fresca de bezerros entre 1,5 e 2 anos de idade. Em seguida, disseque suavemente o joelho da panturrilha, primeiro removendo o excesso de carne, descobrindo os condyles, menisco, tendões e membrana sinovial.
Corte os tendões e a membrana sinovial permitindo que a articulação se desmembre. Remova o menisco para expor os condyles femorais. Use um perfurador de biópsia de três milímetros para isolar explantas da área de rolamento de carga dos condyles femorais e soltá-las da superfície auricular cortando com um bisturi paralelo e o mais próximo possível do osso subcondral.
Armazene imediatamente e misture as explantas no meio de cultura glutimax DMEM F12 contendo 1%de penicilina e estreptomicina em um tubo de 50 mililitros ou placa de Petri. Para iniciar a colheita tecidual, transfira as explanações para uma placa de poço estéril de 96 em um capô de fluxo laminar colocando todas as réplicas dentro de cada grupo na diagonal para minimizar a variação induzida pela evaporação. Adicione PBS aos poços externos da placa de cultura para evitar ainda mais a evaporação do supernante.
Em seguida, lave as explantas três vezes em meio de cultura ou PBS. Cultura as explanações em 200 microliters de cultura média por poço até o início do experimento por até 10 semanas em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Se aplicar algum tratamento, prepare-os para a concentração desejada nos poços de explantação por diluição no meio de cultura antes de mudar o meio.
Mude o meio de cultura a cada dois ou três dias em um capô de fluxo laminar. Remova suavemente o supernatante de cada poço e transfira-o para uma nova placa de 96 poços para armazenamento. Adicione imediatamente 200 microliters de meio de cultura fresca ou tratamento a cada poço.
Não deixe as explantas secarem durante a mudança média e certifique-se de que todas as explantas estejam completamente submersas no novo meio. Sele a nova placa com fita de vedação e armazene-a a menos 20 graus Celsius para análise biomarcadora de rotatividade tecidual e expressão proteica. Para iniciar um teste de resazurina, faça uma solução de meio de cultura contendo 10% de resazurina.
Colher o supernante como descrito anteriormente e imergir as explantas na solução de resazurina de 10% a 37 graus Celsius por três horas ou até que os supernantes ficam roxos. Em seguida, transfira a solução de resazurina condicionada e de controle de fundo para uma placa de microtâmio preto e meça a fluorescência em uma excitação de 540 nanômetros e uma emissão de 590 nanômetros. Depois disso, submergir as explantas em meio de lavagem por cinco a 10 minutos para permitir que a resazurina se difunda completamente e adicione novos meios de cultura ou tratamentos, se usado.
Continue medindo a atividade metabólica uma vez por semana como uma medida indireta da viabilidade celular. Neste estudo, as explantas de profundidade total bovina são isoladas, cultivadas e tratadas. As explanações são divididas em quatro grupos para tratamento, incluindo os tratados com Oncostatin M e fator de necrose tumoral alfa, aqueles tratados com Oncostatin M e fator de necrose tumoral alfa com GM 6001, aqueles tratados com fator de crescimento de insulina um, e um controle sem tratamento.
A atividade metabólica é relativamente estável ao longo das três semanas para todos os quatro grupos. A tendência era que o IGF-1 aumentasse e os grupos O mais T diminuíssem em relação ao controle. O mais T é então aplicado a poços de cultura três vezes por semana para investigar a degradação da cartilagem mediada O plus T.
O mais T é visto para aumentar a degradação do colágeno tipo dois do sétimo para o 21 e a degradação aggrecan dos dias três para 14 em comparação com o grupo controle. Adicionar GM 6001 em combinação com O plus T bloqueia o lançamento do C2M mediado O plus T, mas só tem efeito limitado no AGN X1 com níveis semelhantes ao grupo O plus T no dia 10. Insulina como fator de crescimento um é aplicado três vezes por semana em explantes de profundidade total bovina para investigar como módulos de estimulação anabólico a cartilagem ECM rotatividade.
O efeito do IGF-1 nas explantas da cartilagem foi observado principalmente nas medidas de formação de colágeno tipo dois, como esperado para estímulos anabólicos. Ao tratar com IGF-1, os níveis pró-C2 diminuem menos do que os observados no grupo controle, indicando que o IGF-1 estimula a formação de colágeno tipo dois a partir do sétimo dia. As explantas podem se deteriorar ao longo do tempo e, portanto, a pipetação cuidadosa é fundamental em todas as etapas de tratamento e lavagem, a fim de não perder ou destruir explantas nas diferentes etapas de troca de mídia.
Os resultados gerados com esse modelo não devem ficar sozinhos, mas ser suportados por dados gerados no tecido humano, bem como no celular e em modelos mais recentes para validar ainda mais os achados. Para lançar luz sobre o mecanismo subjacente no tecido e não apenas os resultados, é possível analisar mais tanto tecidos quanto supernantes usando outras técnicas de biologia molecular, como análise de expressão genética e proteica, ou imunohistoquímica, ou outras técnicas permanentes de biologia molecular.
