Agradecemos aos professores, bolsistas, residentes e médicos assistentes do Hospital Brigham and Women, o Departamento de Patologia para a tomada de tecido disponível para estes estudos. Este trabalho foi suportado por concessões de pesquisa do NIH / National Cancer Institute (P50 CA105009, K08 CA108748, U01 CA152990), ovário Cancer Research Fund, The May Kay Foundation, Novartis Pharmaceuticals, Robert e Deborah First Fund, Randi e Joel cancro do ovário Cutler Research Fund, Marsha Rivkin Foundation - Prêmio Acadêmico Científico, AACR - George e Patrícia Sehl Fellowship para Cancer Genetics, da Investigação e da Sociedade Médica Americana de Medicina em Israel - Claire e Emmanuel G. Rosenblatt Foundation Grant.

1. Preparação de colágeno e Coating Filter. <ol><li> Para preparar o colágeno da placenta humana, tweeze out 30 mg de colágeno da placenta humana e colocou em cima de 50 ml de água destilada (dH 2 O) em um copo de 500 ml com barra de agitação. </li><li> Adicionar 100 μls de ácido acético glacial diretamente sobre o colágeno para torná-lo mais fácil de dissolver. Quente a 37 ° C e mexa para dissolver o colágeno. Deve dissolver em 20-30 minutos. Se fios de colágeno permanecem em solução, a esterilização do filtro será difícil. </li><li> Diluir o estoque de 50 ml com 450 ml de dH 2 O e filtro-esterilize com uma membrana M 0,2. Esta é a solução final de trabalho. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Prepare membranas Transwell filtrar por revesti-los com colágeno (50-100 mL) durante a noite. Colágeno refrigerados devem ser aquecidos para RT e então adicionado ao compartimento superior para cobrir a membrana durante a noite e em temperatura ambiente. Antes de revestimento do tubo primário dissociada falópio (FT) epitélio (ver abaixo) para os filtros Transwell, lavar os filtros de três vezes em solução salina tamponada com fosfato de 1X (PBS), pelo menos, uma hora antes do uso para remover o excesso de colágeno. </li></ol> 2. Coleta de Tecidos e dissociação. <ol><li> Trompa de Falópio fresco (FT) fimbria deve ser coletado em 1X PBS estéril em um tubo de centrífuga de 50 ml e mantidos em gelo antes da prompt de processamento em uma capa estéreis de cultura de tecidos. </li><li> Lavar a amostra de tecido vez em 20 ml refrigerados 1X PBS (se a amostra foi coletada em outro tipo de mídia ou é lavar com sangue, pelo menos, 3X para se livrar de tanto sangue e meios de comunicação estrangeiros quanto possível, como isso poderia interferir com a eficiência plating). </li><li> Usando FT transferência estéril pinças para a 10 centímetros placa de cultura de tecidos com um pouco de PBS e, usando uma pinça estéril bisturi e estéril, cortado longitudinalmente para maximizar a exposição das células epiteliais. Abrir a fimbria de modo que não é mais um tubo, mas uma folha de quase plana de tecido. Em seguida, corte em pedaços menores, mas ainda recuperável (cerca de 3 mm de diâmetro). </li><li> Transferência de peças para 45 ml de refrigerados dissociação media (MEM contendo 1,4 pronase mg / ml e 0,1 mg / ml DNAse) em um tubo de 50 ml. </li><li> Rocha suavemente a 4 ° C por 24 a 72 horas. (A partir da experiência, 48 horas é o ideal). Para verificar a quantidade de dissociação, coloque uma gota de dissociação de mídia em um slide e verificar quantidade de aglutinação e viabilidade do tecido (batendo células ciliadas). Você quer ver ambas as células individuais e alguns pequenos aglomerados. </li></ol> 3. Plating trompa de Falópio. <ol><li> Quando a quantidade de dissociação das células epiteliais é a ideal, inativar os meios de comunicação, adicionando volume 10% do FBS. Inverter algumas vezes para desalojar a suspensão de células em agregados menores. </li><li> Permitir aglomerações de tecido grosso (tecido do estroma) para assentar no fundo do tubo. Remova a mídia contendo células epiteliais em um tubo ml segundo 50. </li><li> Adicionar 50 ml de MEM frio (sem FBS) ao tubo original 50 ml. Inverter para coletar células adicionais. Coletar mídia em um tubo de 50 ml terceiro (se a amostra é muito grande e um elevado número de células é esperado, este passo pode ser repetido para maximizar a coleta de células). Os grandes pedaços de tecido do estroma / extracelular agora pode ser descartado. Você tem agora duas tubos de 50 ml de suspensão de células. Centrifugar a 1000 rpm por 5 minutos e mídia aspirar a dissociação de pellets de células. </li><li> Ressuspender em cerca de 5-10 ml de USG media (DMEM: F12 suplementado com USG 2% e 1% Pen Strep) aquecido a 37 ° C. Pipeta suavemente. Tenha cuidado para não pipetar muito vigorosamente, pois isso pode danificar as células epiteliais e reduzir a qualidade das culturas. Deve haver uma única célula e pequenos aglomerados (Figura 1). </li><li> Transferir para placas de cultura de Primaria e incubar por um mínimo de 1 hora ou até 3 horas. Fibroblastos e células vermelhas do sangue vai ficar com o plástico, mas as células epiteliais FT não. Dê uma olhada na placa depois de uma hora para ver se algo está furando. A presença de células ciliadas pode ser visto observando-se o bater dos cílios. </li><li> Durante esta incubação, filtros de colágeno revestido pode ser lavado e preparado para revestimento de células (Veja o passo 1.4) </li><li> Depois de 1-3 horas de incubação nas placas Primaria, transferir a suspensão celular a um tubo de 15 ml e lavar o prato Primaria com 5 ml USG mídia, essa mídia de transferência para o tubo para fazer um volume final de 15 ml. Centrifugar a 1000 rpm por 5 minutos. </li><li> Aspirar cuidadosamente meios de comunicação e não perturbar o pellet celular. A julgar pelo tamanho da pelota, ressuspender na quantidade adequada de USG mídia. (Geralmente entre 1-3 ml) Menos é melhor no início para que você possa diluir ainda mais se você precisar. Ressuspender suavemente. </li><li> Adicionar 10 ml de células em suspensão para um hemocitômetro e determinar a densidade celular. Dicas: Você está à procura de células epiteliais que possuem uma membrana celular distintamente escuro e não são colunares. Você também pode contar células ciliadas que são definitivamente em movimento. Células menores que têm uma auréola appearance são células vermelhas do sangue e não deve ser contado. Haverá alguma aglomeração, então você precisa para estimar que em você contagem de células. A meta de plantio é de 1,65 x10 5 células / membrana, ou pelo menos 75% de cobertura de filtro (Figura 1). Se as células são banhados muito pouco, as células não será capaz de formar uma camada completa epiteliais. </li><li> Adicionar 500 mL da mídia USG para o fundo do poço de uma placa de 24 poços e inserir Transwell. O volume necessário de FT suspensão de células (veja acima) pode ser adicionada em cada membrana, esta é tipicamente 100 ul. </li><li> Incubar e crescer durante 1-2 dias sem perturbar topo da membrana. Você pode alterar a mídia no lado basal durante aqueles dias, se necessário. Depois de 1-2 dias, você pode lavar cuidadosamente a parte superior com USG mídia e adicionar uma pequena quantidade (50-100 L) de mídia em cima da membrana. É mais fácil determinar a confluência de culturas de células se a mídia é removida do lado apical dos filtros antes de microscopia. O compartimento inferior deve sempre conter meios de comunicação. Uma vez que as culturas são totalmente confluentes (normalmente dentro de 5 dias), o montante de mídia que viaja através dos filtros do basal para os lados apical deve ser insignificante. </li><li> Troque a mídia basal uma vez a cada dois dias para os primeiros 10 dias. O compartimento inferior deve ter sempre meios de comunicação para manter as células vivas. Uma vez que as células formaram uma camada epitelial apertado (Figuras 1 e 2) elas podem ser usadas em estudos futuros, tais como imunofluorescência (IF) ou imuno-histoquímica (IHQ). </li></ol> 4. Processamento de membrana. <ol><li> Processamento de membrana é dependente do tipo de estudo que será realizada, mas normalmente envolve a remoção do filtro da Transwell insere. </li><li> Os filtros são normalmente lavadas 3 vezes em 200 mL de 1X PBS antes da remoção. </li><li> Aspirar PBS de um lado apical e basal dos filtros. Isto deve ser feito um bem de cada vez para evitar que as membranas de secar. </li><li> Remover a inserção da placa, flip-la de cabeça para baixo e usar um bisturi estéril para cortar ao redor da membrana. Tentar remover a membrana em uma única peça, fazendo cortes retos ao redor da borda da membrana, em vez de arrastar o bisturi ao redor da borda. </li><li> Use uma pinça para remover o filtro a partir da inserção, mantendo a par de que lado as células estão em. O filtro pode então ser processado para a IF, IHC, etc conforme o caso. </li><li> Exemplo: para IF estudos, o filtro (após a permeabilização de fixação, bloqueio e incubação com anticorpos adequados, de acordo com a norma procedimentos IF) deve ser colocado sobre uma lâmina, células para cima, Vectashield com DAPI é jogada sobre o filtro e cobertos com um vidro lamela. </li></ol> 5. Resultados representativos: Os filtros transwell possam ser facilmente removidos para examinar o epitélio ex vivo por ambos os imuno-histoquímica (IHQ) e de imunofluorescência (IF). Utilizando marcadores específicos da linhagem, pode-se imagem e quantificar o secretora (PAX8 positivo) e ciliadas (Sall2 positivo) compartimentos da célula nestas culturas (Figura 3). Além disso, utilizando esses marcadores, pode-se monitorar a forma como cada tipo de célula responde a diferentes estímulos fisiológicos 10. Este sistema tem sido utilizado para caracterizar as mudanças na phosphoproteome secretome e intracelular do epitélio FT em resposta a diversos estímulos. <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Ilustração mostrando como ex vivo culturas são gerados a partir de tecido humano tubo primário de falópio. Tecido trompa de Falópio fimbrial é obtido a partir do centro cirúrgico e picada de gerar pequenos fragmentos 1, que são lavadas e incubadas com dissociação de mídia para 24-72 horas 2. Após a dissociação é completa, os fragmentos de tecido são autorizados a se depositar no fundo do tubo de incubação e da mídia contendo as células epiteliais dissociada é colhida 3. A eficiência de dissociação pode ser monitorado por exame ao microscópio de contraste de fase 4. As células epiteliais são, então, dissociado cultivadas em placas de Primaria para ajudar a remover fibroblastos e células hematopoiéticas que, invariavelmente, misturados com as células epiteliais 5. Uma vez que as células não epiteliais são adequadamente removidos, as células epiteliais são semeados em filtros transwell que são revestidos com colágeno placentário humano 5. Os meios de comunicação é fornecida pela difusão através da transwell de baixo. As culturas são incubadas por 24-48 horas e depois a mídia apical é removida. As culturas ex vivo são então autorizados a crescer por 5-8 dias para formar um gramado, cheio completas sobre os filtros transwell. As culturas ex vivo pode ser mantida de forma viável nesse estado por até 4 semanas. O cartoon 5 mostra uma representação da cultura vivo totalmente crescidas ex com um exemplo de um filtro removido da inserção e corado com hematoxylin e eosina (H &amp; E) para demonstrar a polaridade e arquitetura do epitélio ex vivo. <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Microscopia de campo claro de culturas FT ex vivo. Inserções Transwell são revestidos com humano poros 0.4μm placentária colágeno são visíveis (a). Células epiteliais FT são cultivadas em inserções de colágeno revestido (b), onde formam uma camada epitelial (c). Alguns detritos é normalmente aderidos às células epiteliais na cultura (indicado por setas), na maioria das vezes para as células ciliadas. <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. FT ex vivo da cultura de imunofluorescência (IF). Exemplos de SE imagens de culturas vivo ex fixados e corados com anticorpos contra o (a) de secreção (PAX8) e (d) células ciliadas (Sall2) marcadores. DAPI é usado como um controle para a localização de núcleos celulares (azul) (b e e) e do anticorpo fundidas e coloração DAPI também é mostrado (c e f). O número de células depende da duração do tempo as células estão em cultura (PAX8 coloração, 7 dias; Sall2 coloração, 3 dias).

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Dr. Drapkin é um consultor para a Novartis Pharmaceuticals. Outros autores não declaram qualquer potencial conflito de interesse.

A identificação da FT como um site de candidato de origem para o SOC fornece a oportunidade para a pesquisa básica e translacional destinada a decifrar os mecanismos que ligam fatores de risco conhecidos eo processo serosa real cancerígenos. Crítica para isso é o desenvolvimento de sistemas modelo tratável que vai nos permitir começar a testar a hipótese de que o FTSEC é uma célula de origem para pélvica carcinomas serosos. O modelo de cultura ex vivo aqui descrito é um sistema inovador que permite o isolamento e co-cultura de secreção FT primária e células ciliadas de forma que preserva a morfologia e biologia do epitélio FT nativa. Usando este sistema, que recentemente caracterizou a secretome deste epitélio e como o epitélio responde à agressão mecânica e genotóxicos 10. Ovulação, um importante fator de risco associado a tumorigênese de ovário, é caracterizada por uma combinação de lesão tecidual, mediadores inflamatórios, fatores de crescimento e hormônios 11. Este sistema poderia ser usado para estudar o efeito de um ambiente sobre a resposta ovulatória e viabilidade de células ciliadas e secretoras. Além disso, o impacto de outros tipos de células (células inflamatórias ou seja) poderia ser examinado para permitir uma melhor compreensão dos eventos que a diferenciação de células da unidade-tipo e os fatores que contribuem para a transformação neoplásica destas células. Modelos similares já foram descritos em outros tecidos onde epitélio polarizado está presente. Por exemplo, em culturas primárias de polarizada epitélio das vias aéreas, o efeito da heregulin no crescimento celular e resposta a lesão celular foi avaliada 12. Estes tipos de sistemas modelo fornecer uma maneira nova e útil para estudar a iniciação e patogênese dos tumores que surgem a partir de tecidos epiteliais, e isso é de importância crítica em tecidos como o FT, onde não há linhas de células existem atualmente, e onde há um grande necessidade de identificação das vias principais e desenvolvimento de estratégias de tratamento da novela.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C7521</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM:F12 media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>15-090-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultroser G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Crescent Chemical Company</td>
<td>67042</td>
<td>Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration)</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Primaria culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>353802</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24 well Transwell Permeable supports</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning (Costar)</td>
<td>3470</td>
<td> Clear, 6.5 mm insert, 0.4 &mu;m pore size, treated polyester </td>
</tr>
<tr>
<td>MEM (Minimal Essential Media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pronase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11459643001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNAse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>DN25</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sall2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dr T. Benjamin, Harvard</td>
<td>Gift</td>
<td>1:20 dilution</td>
</tr>
<tr>
<td>Pax8 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Proteintech</td>
<td>10336-1-AP</td>
<td>1: 1000 dilution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

ex vivo culture of primary human fallopian tube epithelial cells

Câncer epitelial de ovário é a principal causa de mortalidade por câncer do sexo feminino nos Estados Unidos. Em contraste com outras mulheres específicos cânceres, como de mama e carcinomas uterinos, onde as taxas de mortalidade têm caído nos últimos anos, as taxas de cura do câncer de ovário têm permanecido relativamente inalterado ao longo das duas últimas décadas 1. Isto é principalmente devido à falta de instrumentos de triagem apropriados para a detecção da doença fase inicial onde a cirurgia ea quimioterapia são mais eficazes 2, 3. Como resultado, a maioria dos pacientes apresentam doença em estágio avançado e envolvimento abdominal difusa. Isto é ainda mais complicada pelo fato de que o câncer de ovário é uma doença heterogênea com múltiplas subtipos histológicos 4, 5. Carcinoma de ovário seroso (SOC) é o subtipo mais comum e agressivo ea forma mais frequentemente associado com mutações nos genes BRCA. Atuais modelos experimentais neste campo envolvem o uso de linhas de células cancerígenas e os modelos de mouse para melhor compreender os acontecimentos de iniciar genética e patogênese da doença 6, 7. Recentemente, a trompa de Falópio surgiu como um site da novela para a origem da SOC, com a trompa de falópio (FT) célula secretora do epitélio (FTSEC) como o celular proposta de origem 8, 9. Actualmente não há linhas de células ou de sistemas de acesso à cultura a estudar o epitélio FT ou o FTSEC. Aqui nós descrevemos um romance ex sistema de cultura in vivo, onde células primárias de humanos FT epiteliais são cultivadas de forma que preserva sua arquitetura, polaridade, imunofenótipo e resposta a estressores fisiológicos e genotóxicos. Este modelo ex vivo fornece uma ferramenta útil para o estudo da SOC, permitindo uma melhor compreensão sobre como os tumores podem surgir a partir deste tecido, e os mecanismos envolvidos na iniciação e progressão tumoral.

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Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

A trompa de falópio (FT) está emergindo como um local alternativo de origem para o carcinoma de ovário seroso (SOC). Este protocolo descreve um novo método para o isolamento e<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultura de células epiteliais trompa de Falópio. Este recapitula o sistema<em&gt; In vivo</em&gt; Epitélio e permite o estudo da patogênese da SOC.

Ex Vivo de Cultura Primária células epiteliais trompa de Falópio

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

ex-vivo-culture-of-primary-human-fallopian-tube-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

19.5K visualizações.  Dana-Farber Cancer Institute. A trompa de falópio (FT) está emergindo como um local alternativo de origem para o carcinoma de ovário seroso (SOC). Este protocolo descreve um novo método para o isolamento e Ex vivo Cultura de células epiteliais trompa de Falópio. Este recapitula o sistema In vivo Epitélio e permite o estudo da patogênese da SOC.

Vídeo: Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biologia

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

Primárias células epiteliais brônquicas humanas Grown a partir de explantes

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolamento e Cultura de Células-Tronco Adultas epitelial da pele humana

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentivirus mediada Durante Knockdown Ex Vivo Eritropoese de Células-Tronco Hematopoéticas

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Ex vivo Cultura do Rato Embryonic pele e Live-imaging de Migração melanoblasto

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of airway cell differentiation and function. In the past few years, the use of lentiviral vectors for transgene delivery became common practice. While there are reports of transduction of fully differentiated airway epithelial cells with certain non-HIV pseudo-typed lentiviruses, the overall transduction efficiency is usually less than 15%. The protocol presented here provides a reliable and efficient method to produce lentiviruses and to transduce primary human bronchial epithelial cells. Using undifferentiated bronchial epithelial cells, transduction in bronchial epithelial growth media, while the cells attach, with a multiplicity of infection factor of 4 provides efficiencies close to 100%. This protocol describes, step-by-step, the preparation and concentration of high-titer lentiviral vectors and the transduction process. It discusses the experiments that determined the optimal culture conditions to achieve highly efficient transductions of primary human bronchial epithelial cells.

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

Optimal Lentivírus produção e cultura celular condições para sucesso pilhas transdução primária brônquicas humanas epiteliais

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II cells and two types of immune cells (i.e., human monocyte-derived macrophages [MDMs] and dendritic cells [MDDCs]). A protocol for assembling the multicellular model is provided. Alveolar epithelial cells (A549 cell line) are grown and differentiated under submerged conditions on permeable inserts in two-chamber wells, then combined with differentiated MDMs and MDDCs. Finally, the cells are exposed to an air-liquid interface for several days. As human primary immune cells need to be isolated from human buffy coats, immune cells differentiated from either fresh or thawed monocytes are compared in order to tailor the method based on experimental needs. The three-dimensional models, composed of alveolar cells with either freshly isolated or thawed monocyte-derived immune cells, show a statistically significant increase in cytokine (interleukins 6 and 8) release upon exposure to proinflammatory stimuli (lipopolysaccharide and tumor necrosis factor &#945;) compared to untreated cells. On the other hand, there is no statistically significant difference between the cytokine release observed in the cocultures. This shows that the presented model is responsive to proinflammatory stimuli in the presence of MDMs and MDDCs differentiated from fresh or thawed peripheral blood monocytes (PBMs). Thus, it is a powerful tool for investigations of acute biological response to different substances, including aerosolized drugs or nanomaterials.

Presented here is a protocol for primary human blood monocyte isolation as well as their differentiation into macrophages and dendritic cells and assembly with epithelial cells into a multicellular human lung model. Biological responses of cocultures composed of immune cells differentiated from either freshly isolated or thawed monocytes, upon exposure to proinflammatory stimuli, are compared.

Modelo Alveolar Humano Multicelular Composto por Células Epiteliais e Células Imunes Primárias para Avaliação de Riscos

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

Isolamento e enriquecimento de células progenitoras epiteliais pulmonares humanas para a cultura organoide

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a multifactorial disease influenced by environmental and genetic factors, which lead to functional impairment of the retina due to retinal pigment epithelial (RPE) cell degeneration followed by photoreceptor degradation. An ideal treatment would include the transplantation of healthy RPE cells secreting neuroprotective factors to prevent RPE cell death and photoreceptor degeneration. Due to the functional and genetic similarities and the possibility of a less invasive biopsy, the transplantation of iris pigment epithelial (IPE) cells was proposed as a substitute for the degenerated RPE. Secretion of neuroprotective factors by a low number of subretinally-transplanted cells can be achieved by Sleeping Beauty (SB100X) transposon-mediated transfection with genes coding for the pigment epithelium-derived factor (PEDF) and/or the granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF). We established the isolation, culture, and SB100X-mediated transfection of RPE and IPE cells from various species including rodents, pigs, and cattle. Globes are explanted and the cornea and lens are removed to access the iris and the retina. Using a custom-made spatula, IPE cells are removed from the isolated iris. To harvest RPE cells, a trypsin incubation may be required, depending on the species. Then, using RPE-customized spatula, cells are suspended in medium. After seeding, cells are monitored twice per week and, after reaching confluence, transfected by electroporation. Gene integration, expression, protein secretion, and function were confirmed by qPCR, WB, ELISA, immunofluorescence, and functional assays. Depending on the species, 30,000-5 million (RPE) and 10,000-1.5 million (IPE) cells can be isolated per eye. Genetically modified cells show significant PEDF/GM-CSF overexpression with the capacity to reduce oxidative stress and offers a flexible system for ex vivo&#160;analyses and in vivo studies transferable to humans to develop ocular gene therapy approaches.

Here, a protocol to isolate and transfect primary iris and retinal pigment epithelial cells from various mammals (mice, rat, rabbit, pig, and bovine) is presented. The method is ideally suited to study ocular gene therapy approaches in various set-ups for ex vivo&#160;analyses and&#160;in vivo studies transferable to humans.

Isolamento, Cultura e Engenharia Genética de Células Epiteliais de Pigmento Primário mamífero para terapia genética não viral

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Dissecção eficiente e cultura de células epiteliais de pigmento de retina do rato primário

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...