The work was supported by grants from the Universit&#233; catholique de Louvain (Action de recherch&#233; concert&#233;es) and the Fund for Scientific Medical Research (F.R.S.-FNRS, Belgium). A.-S.D. is a doctoral fellow from T&#233;l&#233;vie, A.-C.H. held a fellowship from the Fonds pour la formation &#224; la Recherche dans l'Industrie et dans l'Agriculture (Belgium), M.V. is supported by the de Duve Institute and C.E.P. is a senior research associate of the F.R.S.-FNRS (Belgium).

Ratos foram levantadas e tratadas de acordo com os princípios de cuidados com animais de laboratório do Comitê de Bem-Estar Animal da Universidade. Todos os procedimentos e protocolos foram aprovados por esta Comissão. 1. Revestimento de Microscopia de plástico Chambers Cultura NOTA: Executar os seguintes passos sob condições estéreis numa câmara de fluxo laminar. Os dois tipos de revestimento são funcionalmente equivalentes. <ol><li> Câmaras de cultura Brasão de plástico com fibronectina um dia antes do isolamento dos tecidos de tireóide: <ol><li> Dilui-se a fibronectina, estéril até uma concentração final de 50 ug / ml, em meio M199 suplementado com 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 0,25 mg / ml de fungizona e 2 mM de glutamina 12. </li><li> Cobrir os poços com 200 ul de fibronectina diluído e incubar durante a noite num frigorífico a 4 ° C. </li><li> No dia da dissecção, aspirar a fibronectina, lavar os poços uma vez com M199 e adicionar um volume mínimo de 200 mL de M199 suplementado com antibióticos, glutamina e 10% de soro fetal de vitelo. </li><li> Deixe as câmaras revestidas na incubadora até que esteja pronto para a chapa explantes. </li></ol></li><li> Câmaras de cultura de plástico revestimento com colágeno tipo I de 2 horas antes do isolamento dos tecidos da tireóide: <ol><li> Diluir tipo estéril colagénio até uma concentração final de 50 ug / ml em HCl 10 mM. NOTA: Mantenha solução estoque de colágeno no gelo. </li><li> Cobrir os poços com 200 ul de tipo I de colagénio diluído e incuba-se durante 2 horas à temperatura ambiente (RT). </li><li> Aspirar o colagénio do tipo I solução, lavar os poços uma vez com M199 e adicionar um volume mínimo de 200 mL de M199 suplementado com antibióticos, glutamina e 10% de soro fetal de vitelo. </li><li> Deixe as câmaras revestidas na incubadora até que esteja pronto para a chapa explantes. </li></ol></li></ol> 2. Dissecção da tireóide Anlagen contendo tecidos (E12.5) ou tireóide Lobos (E13.5-e14.5) NOTA: Use ferramentas de dissecação limpa e placas de Petri / cultura. Os passos gerais e incisões descritos abaixo são os mesmos para os embriões E12.5 e E14.5. <ol><li> Sacrifício cronometrado grávida camundongos fêmeas na embrionário desejada (e) o dia (das E12.5 a E14.5) e remover o útero por meio de instrumentos de dissecação. </li><li> Colocar o útero dissecado em uma placa de 10 cm, que inclua HBSS. </li><li> Segurar uma extremidade do útero com uma pinça e abrir o útero com pequenas tesouras para libertar progressivamente todos os embriões. </li><li> Separa-se os embriões a partir de placenta com uma tesoura e transferir os embriões com as suas membranas extraembryonic numa nova placa de 10 centímetros contendo HBSS. </li><li> Retire o saco vitelino e âmnio. NOTA: A partir deste ponto, trabalhar sob um microscópio estereoscópico com transillumination abaixo; aumentando a ampliação com passos de dissecação. Use agulhas de tungstênio em capilares de vidro como dissecando ferramentas. </li><li> Usando as agulhas comogarfo e faca, retire a parte superior da cabeça, incluindo a mandíbula superior e os ouvidos (Figura 1A, corte ao longo de uma). </li><li> Segurar o embrião em sua volta e remover primeiro uma peça adicional de tubo neural (Figura 1A, cortado ao longo de b), em seguida, a parte inferior do embrião, logo abaixo dos membros anteriores e acima do coração (Figura 1B). </li><li> Transfira a fatia contendo embrião da língua (para orientar o tecido) e na região do pescoço em uma nova placa de 10 centímetros contendo HBSS. </li><li> Remover o tubo de tecidos neurais e posterior ao esófago / traqueia (Figura 1C, cortado ao longo de um). </li><li> Suavemente secção da fatia de tecido ao longo de ambos os lados da lingueta (Figura 1C, cortado ao longo de B e B &#39;). </li><li> Localize o esófago e a traqueia, no prolongamento da lingueta, e dissecar afastado da língua, deixando o aritenóide inchaço (Figura 1E, cortado ao longo de um), e o tecido no both lados do esófago / traqueia (Figura 1E, cortado ao longo de B e B &#39;). </li><li> Retire o esôfago, e coloque a traquéia com o lado ventral para cima. </li><li> Dissecar embora os tecidos não desejados, tais como o timo (Figura 1E) e todos os tecidos localizados lateralmente ao arco artérias da faringe. Para E13.5 ou embriões E14.5, visualizar os lóbulos da tiróide em cada lado da traqueia (Figura 1F; linhas pontilhadas vermelho) e dissecar ainda mais os lóbulos da traqueia. </li><li> Transferir a região E12.5 traqueia isolada, ou os lóbulos da tiróide E13.5-E14.5 numa placa de cultura de 35 milímetros contendo meio de pré-aquecido M199 suplementado com antibióticos, glutamina e 10% de soro fetal de vitelo. Explantes de transferência usando uma ponta de filtro prewetted em um P-200 micropipeta. Para explantes E12.5, corte a extremidade da ponta para alargar a abertura. NOTA: Rotineiramente, e se os embriões têm o mesmo genótipo, execute os passos 6 e 7 em todos os embriões, on 9-11, e, finalmente, 12 e 13. </li></ol> 3. Chapeamento e Cultura de explantes da tireóide <ol><li> Lave os explantes por transferência sucessiva de três cavidades de uma placa de 24 poços contendo 1 ml de meio de cultura pré-aquecido (= M199 suplementado com antibióticos, glutamina e 10% de soro fetal de vitelo). </li><li> Chapeamento de lobos da tireóide sobre câmaras de cultura de plástico revestidas de microscopia: <ol><li> Aspirar M199 meio de cultura das câmaras revestidas. </li><li> Cuidadosamente, transferir os explantes de tireóide nas câmaras de cultura, utilizando uma micropipeta e filtro dicas. Colocar um explante no centro de cada uma das câmaras. </li><li> Remover o excesso de meio e colocar a câmara de cultura numa incubadora de cultura de tecidos (37 ° C, 5% CO 2) durante 2 horas para permitir que os explantes anexar à matriz. </li><li> Adicionar cuidadosamente de 200 a 300 ul de meio de cultura pré-aquecido a cada poço. </li><li> Incubar durante a cultura a longo prazo na incubadora de cultura de tecidos. </li></ol></li><li> Chapeamento of região traquéia ou da tiróide lobos em filtros semiporous: <ol><li> Encher o número de cavidades de uma placa de 24 poços com 330 ul necessária de meio de cultura de pré-aquecido. </li><li> Filtros lugar (por exemplo, 0,4 mM filtro Millipore) no meio, tomando cuidado para evitar aprisionamento de bolhas de ar abaixo do filtro de cultura. </li><li> Cuidadosamente, utilizando uma micropipeta e pontas de filtro, transferir os explantes da tiróide com um volume mínimo de meio para o centro dos filtros (máximo 4/filter). </li><li> Retire o excesso de médio e espaço os explantes com uma agulha de tungstênio. </li><li> Incubar durante a cultura a longo prazo na incubadora de cultura de tecidos. NOTA: Alterar meio de cultura a cada dois dias sob a capela de fluxo laminar. Cultura explantes de até 7 dias. </li></ol></li></ol> 4. Todo-mount Imunofluorescência Coloração Protocolo para explantes da tireóide Desalojar explantes cresceram em filtros (depois do passo 2 abaixo), utilizando as agulhas de tungsténio ouuma pinça fina e transfere-se uma placa de 24 poços para todos os passos, excepto para o primário (passo 5) e secundário (passo 7) incubações do anticorpo (placa de 96 poços). Para explantes aderentes cultivadas em câmaras de plástico de microscopia, execute todas as etapas nas câmaras de cultura. <ol><li> Aspirar M199 meio de cultura e corrigir o explante com gelado de 4% paraformaldeído (PFA) por 20 min (500 mL em 24 poços prato e 300 mL em lâminas de microscopia). </li><li> Lavar 2x 10 min em solução salina tamponada TRIS com Triton (TBST, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM de NaCl, 0,1% de Triton X-100) à temperatura ambiente. </li><li> Processar os explantes imediatamente ou armazenar a -20 ° C. NOTA: Para o armazenamento a longo prazo a -20 ° C, desidratar os explantes em metanol aumentando gradualmente a concentração de metanol em TBST para atingir 100% de metanol. Quando estiver pronto para continuar com a imunomarcação (passo 4), hidratar os explantes, adicionando gradualmente TBST para metanol. </li><li> Substituir TBST com a solução de bloqueio (10% de soro normal de cabra em TBST) E incuba-se em um balancim mar-serra durante 30-60 min à temperatura ambiente. </li><li> Dilui-se o anticorpo primário em solução de bloqueio (100-200 ul por condição). Transferir os explantes de &quot;filtro&quot; de uma placa de 24 poços para uma placa de 96 poços. Incubar explantes com os anticorpos primários sobre um roqueiro mar-serra durante a noite a 4 ° C. </li><li> No dia seguinte, descartar a solução de anticorpo primário, transferir os explantes de &quot;filtro&quot; de volta em uma placa de 24 poços, e lava-se, pelo menos, cinco vezes com TBST num agitador mar-serra para 45-60 minutos cada à temperatura ambiente. </li><li> Dilui-se anticorpo secundário (por exemplo, anticorpo de cabra anti-X-Alexa Fluor em diluição 1:2000) em TBST contendo 1% de soro normal de cabra e incubar os explantes com esta diluição durante a noite num agitador de mar-serra, a 4 ° C e no escuro. Para coloração de contraste nuclear incluem um ug / ml de bis-benzimida (Hoechst) em conjunto com a solução de anticorpo secundário. </li><li> No dia seguinte, descartar a solução de anticorpo secundário e lavar 5x com TBST em um mar-serrabalancim para 45-60 min cada em temperatura ambiente. Durante as lavagens, manter os explantes no escuro. </li><li> Realizar uma lavagem adicional em TBST agitação suave durante a noite a 4 ° C no escuro. </li><li> Sufixo os explantes imunocoradas em PFA a 4%, a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Lavar 2x 10 minutos com TBST. </li><li> Transferir os explantes ou gradualmente em metanol 100% para o armazenamento a longo prazo a -20 ° C, ou imediatamente analisar. Para explantes cultivados em filtros, e imunocoradas em uma placa de 24 poços, em uma câmara de transferência de microscopia (por exemplo LabTek ou Ibidi) com TBST ou melhor meio de montagem antes da análise de fluorescência com um microscópio confocal ou Multiphoton. </li></ol> 5. Extração de RNA a partir de tiróide Trabalhar em um ambiente livre de RNase. Portanto, use ácido nucleico e nuclease livre pontas de pipeta e limpe ambos bancada e equipamentos de contaminantes e RNases. Este protocolo de ser baseado em fenol / clorofórmio, realizar a primeira etapas (1 a 7), sob um capuz químico. <ol><li> Homogeneizar um explante tireóide ou dois lobos da tireóide com 300 ml de solução de extração de RNA usando um pilão descartável para 1,5 ml tubo. Entre amostras, lavar o pilão em SDS a 2%, depois com água, em seguida com etanol. </li><li> Adicionar mais 100 mL de solução de extracção de ARN, vortex 10 seg e incubar à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Vortex durante 30 segundos e adiciona-se 20 ng de tRNA de cada amostra. </li><li> Vortex durante 1 min e adicionar 80 ul de clorofórmio. </li><li> Vortex vigorosamente durante 30 segundos e incubar 15 min a RT. </li><li> Centrifugação durante 15 min a 19.000 x g num (4 ° C) centrífuga refrigerada. </li><li> Transferir cuidadosamente a fase aquosa superior incolor com um novo tubo contendo 20 ug de glicogénio como co-precipitante. </li><li> Vortex e adicionar 200 mL de 100% de álcool isopropílico. </li><li> Vortex vigorosamente durante 15-30 segundos e deixar precipitado de ARN, a -20 ° C durante 2-3 horas ou a -80 ° C durante 1 hora. </li><li> Girar durante 30 min a 19.000xg, a 4 ° C, e eliminar o sobrenadante. </li><li> Lavar o sedimento com 450 ul de etanol frio a 75% e vortex para desalojar o sedimento. </li><li> Centrifugação durante 10 min a 19.000 xg, a 4 ° C, e eliminar o sobrenadante. </li><li> Seca-se o sedimento sob o capô, durante 5 min. </li><li> Ressuspender o sedimento com 10 ml de água isenta de RNase e incubar 10 min a RT. </li><li> A concentração do RNA ensaio, armazenar a -80 ° C ou a transcrição reversa para análise da expressão do gene. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Este artigo descreve um método para dissecar e cultivo de explantes de tireóide (E12.5) ou lóbulos (E14.5), a fim de estudar e compreender melhor os eventos complexos que levam à formação da tiróide. Devido à dupla origem do Anlagen tiróide (o primórdio da linha média e os dois corpos laterais Ultimobranquial), e seu pequeno tamanho, um fragmento de tecido E12.5 rostral localizada nas artérias arco da faringe, e contendo a traqueia, mas não o esófago é microdissectados. Tal como ilustrado, dentro de um pe...

A glândula tireóide é uma coleção de esferas epiteliais independentes, chamados folículos, cercado por uma densa rede de capilares endoteliais. Esta organização permite que a função da tireóide: capilares endoteliais fornecer tireócitos com iodo, necessários para T3 e T4 síntese de hormônios e distribuir estes últimos para todo o corpo. Espalhados entre os folículos capilares e, células C produzir o hormônio calcitonina hypocalcemic 1. Embora a arquitetura e as funções da tireóide adulto são bem conhecidos, os mecanismos celulares e moleculares envolvidos no desenvolvimento embrionário da tireóide (formação e diferenciação do folículo) estão longe de serem compreendidos. Durante a embriogênese, tireócitos progenitor origina como um espessamento (o primórdio da linha média) da parede ventral da endoderme foregut no dia embrionário (e) 8,5 no embrião de rato, enquanto células C progenitores originam em E11.5 como saliências em forma de gota ( o bo Ultimobranquialmorre) da quarta bolsas faríngeas 2-6. O botão da linha média, em seguida, se desprende da endoderme, expande bilateralmente para fundir em E13.5 com os corpos Ultimobranquial de cada lado da traquéia. Finalmente, tireócitos organizar em folículos e células C diferenciar. O conhecimento atual sobre a formação da tireóide vem principalmente da análise histológica dos tecidos fixos, mas os eventos morfogenéticos envolvidos na formação da tireóide são muito dinâmicos e envolvem comunicações e interações entre os diferentes tipos de células e com a matriz extracelular. Trabalhos recentes mostraram que os progenitores tirócito produzir níveis elevados de VEGF para recrutar células endoteliais para o desenvolvimento da tiróide, e, por sua vez, recrutados células endoteliais e promover a formação de folículo células C diferenciação 7. A maioria dos estudos in vivo ex sobre a tireóide foram realizados em células derivadas de tireóide adultos isolados, produzidas quer em 2D cultura de tecidos de plástico dparóquias ou em matrizes 3D. Usando esses tipos de culturas, as células foliculares diferenciados ou permanecem polarizadas e organizados como folículos ou reaquisição uma organização 3D 8-10. No entanto, estas células epiteliais pura, explantadas de seu ambiente fisiológico, e cultivadas em 2D, ignorar as interacções com a matriz extracelular, citocinas, factores de crescimento e com outros tipos de células tais como as células endoteliais ou nervos que normalmente encontrar in vivo. Um estudo muito bom descreveu recentemente um protocolo de diferenciação de células-tronco embrionárias em folículos tireoidianos usando uma etapa final cultura em matrigel 3D 11. No entanto, a falta de contacto com outros tipos celulares nestas culturas 3D. Com base em experiência anterior no pâncreas e glândulas salivares de cultura de órgãos de 12-14, um método para dissecar rato embrionário Anlagen tiróide e cultivar os explantes sobre filtros semiporous ou em lâminas de microscopia de plástico foi desenvolvido. Quandotrabalhar com embriões E12.5, a dupla origem da anlagen da tireóide (o primórdio da linha média e os dois corpos laterais Ultimobranquial) impôs a microdissecção de um grande fragmento de tecido. Este continha a traquéia, mas não o esôfago, e se estendia desde o arco faríngeo artérias até o inchaço aritenóide. Quando cultivadas em filtros, o primórdio da linha média se estende lateralmente de cada lado da traqueia, onde fundem com os corpos Ultimobranquial para formar os dois lóbulos da tiróide, ainda ligados por um estreito istmo. Em cultura, as células epiteliais proliferam, organizam-se em folículos e diferenciam-se em tireócitos e células C, dependendo da sua origem. As células endoteliais contidas no tecido microdissecção também proliferam e invadem os lobos tireoidianos para finalmente associar estreitamente com a estrutura folicular epitelial, independentemente do fluxo de sangue ou fatores circulantes. Como o desenvolvimento dos explantes recapitula fielmente in vivo desenvolvermento, este sistema de cultura é ideal para estudar morfogenética e eventos de diferenciação que ocorrem durante o desenvolvimento da tiróide. Tecidos da tireóide pode ser obtido a partir de tipo selvagem, nocaute ou embriões transgênicos fluorescentes, eo sistema de cultura é passível de experimentos de ganho de função de perda de e. Finalmente, time-lapse de imagens de explantes de tireóide fluorescente etiquetado em pratos de plástico de microscopia pode ser explorada para melhor investigar a cinética ea continuidade dos movimentos morfogenéticos que ocorrem in vivo. Time-lapse imagem já foi usada para estudar ramificação morfogênese do pâncreas 15,16 ou broto ureteral 17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">&#181;-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile</td>
			<td style="width:85px;">proxylab</td>
			<td style="width:119px;">80826</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen Type I, rat tail</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td>08-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td># 33010-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">M199</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>31150-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">HBSS</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>14025-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Tungsten wire</td>
			<td style="width:85px;">Goodfellow</td>
			<td style="width:119px;">LS237450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">culture plate insert (12 mm diameter)</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">GlycoBlue</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">E-cadherin</td>
			<td style="width:85px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">610182</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">Ezrin</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MS-661-P1</td>
			<td>1/400</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:327px;">PECAM</td>
			<td style="width:85px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">550274</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Hoechst</td>
			<td style="width:85px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo culture system to study thyroid development

A tiróide é uma glândula endócrina bilobated localizada na base do pescoço, produzindo as hormonas da tiróide T3, T4, e de calcitonina. T3 e T4 são produzidos por tireócitos diferenciados, organizados em esferas fechadas chamadas folículos, enquanto que a calcitonina é sintetizado por células C, intercalados entre os folículos e uma densa rede de capilares sanguíneos. Embora arquitectura tiróide adulta e funções têm sido extensivamente estudada e descrita, a formação das unidades de &quot;angio-foliculares&quot;, a distribuição de células C no parênquima e as comunicações parácrinas entre células epiteliais e endoteliais está longe de serem compreendidos. Este método descreve os passos seqüenciais de rato tireóide embrionário anlagen dissecção e sua cultura em filtros semiporous ou em lâminas de plástico de microscopia. Dentro de um período de quatro dias, este sistema de cultura recapitula fielmente no desenvolvimento da tiróide in vivo. Com efeito, (i) bilobation do órgão ocorre (por explante E12.5), (ii) tireócitos precursores organizar-se em folículos e polarizar, (iii) tireócitos e diferenciar células C, e (iv) as células endoteliais presentes no tecido microdissecção proliferam, migram para a lobos da tireóide, e intimamente associado com as células epiteliais, como o fazem in vivo. Tecidos da tireóide pode ser obtido a partir de tipo selvagem, nocaute ou embriões transgênicos fluorescentes. Além disso, a cultura de explantes pode ser manipulada pela adição de inibidores, anticorpos bloqueadores, factores de crescimento, ou até mesmo células ou meio condicionado. Ex vivo de desenvolvimento pode ser analisado em tempo real, ou a qualquer momento da cultura por imunocoloração e RT-qPCR. Em conclusão, a cultura explante tireóide combinado com toda a jusante de montagem ou em seções de imagem e expressão gênica profiling fornece um sistema poderoso para manipular e estudar eventos morfogenéticos e diferenciação de tiróide organogenesis.

Anlages Tiróide (linha média e UB, juntamente com tecidos adjacentes), e os lóbulos da tiróide são dissecados a partir de embriões de rato E12.5 e no e13.5/e14.5, respectivamente (Figura 1). Após um dia de cultura no filtro, o primórdio da linha média é visível (Figura 2A), como um tecido alongado abrangendo no topo da traqueia. Ele forma progressivamente dois lobos de cada lado da traqueia. Se lobos tireoidianos isolados (E13.5 E14.5) ou são cultivadas, eles vão expandir-s...

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An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Uma<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema Cultura para estudar o desenvolvimento da tireóide

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

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An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

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11.4K visualizações.  Université catholique de Louvain & de Duve Institute. This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

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Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biologia

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Um Ex-ovo Sistema de Cultura de embriões de frango Indicado para aplicações de imagem e Microcirurgia

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

Sistema de Protocolo fechado Cultura de Células utilizando navios com HYPERStack Gas Technology material permeável

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

Ex Vivo de Cultura Primária células epiteliais trompa de Falópio

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Um Sistema de<em&gt; Ex vivo</em&gt; A cultura de Pâncreas embrionárias

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Método de Cultura para o Rato coração embrionário

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Rato Desenvolvimento Embrionário em todo um sistema de cultura de embriões sem soro

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Rato Fetal Whole Intestino Sistema de Cultura para<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulação de vias de sinalização e tridimensional Imagens ao vivo de Desenvolvimento Villus

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Desenvolvimento de um Sistema Insert Co-cultura de dois tipos celulares na ausência de célula-célula Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Estabelecimento de um pH extracelular ácido sistema de cultura

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...