Este protocolo permite um exame in vitro em profundidade do micro ambiente ovariano. Permitindo que os usuários determinem o crescimento e o desenvolvimento do folículo, bem como a esteróideogênese e a abundância de moléculas imunes. Uma vantagem dessa técnica é a capacidade de avaliar diretamente as mudanças no ambiente do microcrédito ovariano e dos folículos emergentes e avaliar a interação única causada pela adição de hormônios específicos.
Esta técnica pode ser usada para estudar uma variedade de distúrbios reprodutivos causando prisões foliculares. Por exemplo, síndrome do ovário policístico. Uma vez que podemos avaliar diretamente o micro ambiente ovariano in vitro, demonstrando que o procedimento será Brooke Bell, uma pesquisadora de graduação do meu laboratório.
Usando fórceps ceados, proteja o ovário, corte ao meio e comece a remover fatias externas. Assegurando que não mais do que uma profundidade de uma a duas milímetros de superfície seja cortada do ovário para que nenhuma medula seja coletada. Corte de três a quatro tiras finas do córtex ovariano com um bisturi e coloque as tiras na terceira placa de Petri preenchida pbs.
Corte as tiras em pequenos pedaços quadrados de 0,5 a um milímetro cúbico com uma lâmina de bisturi. Use uma régua por baixo das placas de Petri para garantir que as peças sejam de tamanho e espessura semelhantes para fazer peças consistentes de córtex ovariano. Lave pedaços cortical ovarianos em todas as três placas de PDV e campo antibiótico, usando fórceps de ponta curva para mover as peças entre as lavagens.
Mova peças de córtex através da série de lavagens LB-15 e coloque-as em uma placa final de Petri com preenchimento LB-15. Rotule a tampa com o L animal e o lado ovariano. Colete quatro pedaços de córtex ovariano por ovário e fixe-as para histologia do dia zero e congele peças adicionais para purificação de RNA.
Use as peças de tecido restantes para cultura. Prepare um armário de segurança biológica para uma lavagem final de tecidos e preparação de cultura. Higienize os suprimentos com 70% de etanol antes de colocá-los no armário de segurança biológica.
Mova todas as peças do córtex ovariano destinadas à cultura para o armário de segurança biológica e lave-as mais uma vez em uma placa de Petri cheia de LB-15. Pipeta 350 microliters de waymouth médio por poço em uma placa de cultura de tecido de 24 poços. Coloque as camadas de cultura não revestidas em cada poço usando fórceps, certificando-se de que não se formem bolhas sob a base da inserção.
Posicione cuidadosamente e delicadamente quatro peças de córtex ovariano na malha de cada inserção sem perfurar a malha. Incubar o tecido a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Mude a cultura do córtex ovariano diariamente durante sete dias, certificando-se de usar o meio Waymouth pré-aquecido.
Durante as alterações médias, use fórceps para levantar suavemente a pastilha para fora do poço e coletar o meio Waymouth cultivado em tubos de 0,5 mililitro. Coloque a inserção de volta no poço e adicione 350 microliters de meio de cultura fresca, distribuindo-a entre o lado da pastilha e o poço. Armazene o meio coletado da cultura tecidual a menos 20 graus Celsius.
Após sete dias de cultura, imagem as peças do córtex ovariano usando um microscópio de dissecção com uma câmera conectada e um programa de software de imagem de computador. Fixar duas peças de córtex ovariano por poço na solução de Bouin para histologia e congelamento de flash para pedaços de córtex ovariano em nitrogênio líquido para obter RNA para cDNA. Repita este passo para todos os poços com tecido, em seguida, colete o meio a partir do sétimo dia e armazene-o menos 20 graus.
Deixe que as peças do córtex ovariano permaneçam imersas na solução de Bouin por aproximadamente 1,5 horas, depois lave-as com 70% de etanol três vezes, mantenha o tecido em 70% de etanol e limpe-o diariamente até que a solução não seja mais amarela. A hematoxilina e a mancha de eosina foram realizadas para folículos primordiais, folículos primários, folículo primário, folículo secundário e folículo antral. A encenação do folículo foi conduzida em um córtex ovariano fixado antes e seguindo a cultura para avaliar a foliculogênese.
A diferença na morfologia determinada pela deposição de colágeno pode indicar fibrose no córtex ovariano a partir de escada-passo ou novilhas de controle. Uma comparação da área média de picrosão vermelha de picrosão por córtex ovariano preenchido entre controle e novilhas de escada é mostrada aqui. A coleta diária de meios culturais foi agrupada ao longo de três dias para avaliar a produção variada de hormônios esteroides, usando um radioimuneassay.
Metabólitos de esteroides e produção de citocinas também foram medidos em meio de cultura de córtex ovariano a partir de um poço para cada animal agrupado ao longo de quatro dias de cultura. Quanto mais tempo o tecido fica, mais difícil pode ser trabalhar. Você pode precisar praticar cortes precisos.
Esta técnica é usada para entender os efeitos nas vias de transdução de sinal para resgatar o excesso de esteróidesogênese para determinar os efeitos do excesso de esteroides na produção de citocinas e quimioterapia, e para determinar os efeitos na progressão do folículo ou prisão dentro do tecido ovariano.
