A radiolabeling carbon-11 permite que pequenos compostos sejam usados para tomografia de emissão de pósitrons ou PET sem alterar a molécula. Isso é essencial para investigar os níveis de expressão do receptor. A vantagem da rotulagem de radiolateração de carbono-11 é que podemos usar o PET para avaliar diretamente a cinética de vinculações do SNAP em relação ao receptor hormonal concentrado de melanina em tempo real.
O SNAP como antagonista do receptor hormonal concentrado de melanina contribuirá para uma melhor compreensão deste receptor e sua associação com condições metabólicas como obesidade e diabetes. Transportadores de Efflux expressos na barreira hematoencefálica podem dificultar significativamente o uso de radiofarmacêuticos para imagens de expressão de receptor central. Por isso, é importante avaliar traços in vitro.
A radiosíntese automatizada do SNAP é amplamente aplicável a compostos de baixo peso molecular radiolabeled com um grupo de metila facilmente avaliável. Uma vez estabelecido este procedimento pode ser adaptado para outros compostos. Auxiliando na demonstração estarão as alunas sêniores de doutorado Sarah Pfaff e Theresa Balber.
Para iniciar a síntese SNAP de carbono-11, configure um módulo de síntese automatizada de carbono-11 limpo com os reagentes e materiais apropriados. Inicie o processo de síntese SNAP no computador do módulo que começará com verificações e condicionamento do sistema. Cerca de 30 a 40 minutos antes do módulo estar pronto para a entrega do C-11, selecione o alvo de dióxido de carbono C-11 no ciclotron e inicie o feixe a 65 microamperes.
Uma vez que o módulo esteja pronto para entrega, feche a janela interna e a porta externa. Confirme que a armadilha de CO2 esfriou a pelo menos 40 graus Celsius e que a armadilha de metano começou a esfriar. Uma vez que o ciclotron tenha produzido cerca de 120 gigabecquerels de C-11 CO2 clique OK no software do módulo para abrir o caminho do alvo através da armadilha de CO2.
No computador ciclotron comece a entregar C-11 CO2 para o módulo. Monitore a transferência de atividade no computador do módulo e certifique-se de que ele prossiga para a redução do CO2 para o metano após três minutos. Monitore o processo à medida que o metano resultante é lavado na armadilha do metano e convertido em iodeto de metila por circulação através do forno de iodo.
No final da sequência de conversão, aguarde que os subprodutos sejam liberados da armadilha de iodeto de metila para o escape e, em seguida, confirme que o reator está pronto para receber atividade clicando em OK. Monitore o sistema à medida que o iodeto de metila é liberado da armadilha, lavado através do forno de trifola de metila e preso no reator. Quando a atividade nos platôs do reator confirmar que a captura está completa. Espere enquanto a mistura de reação reage a 75 graus Celsius por três minutos.
Em seguida, monitore o sistema à medida que a mistura de reação é resfriada a menos de 35 graus Celsius e saciada com 1,5 mililitros de água. Monitore o sistema à medida que a mistura de reação é carregada no laço de injeção HPLC e é injetada na coluna HPLC semi-preparatória. Observe os traços do detector UV e gama enquanto a cromatografia prossegue.
Quando o pico do produto começar a aparecer manualmente comece a coletar o produto no frasco de coleta de fundo redondo no módulo. A coleta manualmente termina quando o sinal gama fica abaixo de cerca de 400 contagens por segundo. Observe o nível de fluido no frasco inferior redondo enquanto o produto é carregado em um cartucho de extração de fase sólida sob pressão de hélio.
Uma vez que o frasco esteja vazio e o líquido tenha passado pelo cartucho SPE, clique em OK para começar a lavar os produtos presos no cartucho. Em seguida, monitore a atividade no frasco de coleta de produtos, pois o produto é primeiro elucido do cartucho para o frasco e depois diluído com solução salina de 0,9%. Observe como a solução do produto é transferida para o frasco do produto através de filtro estéril sob pressão de hélio.
Quando a transferência estiver completa, feche a válvula de saída do produto. Quando o radiotracer chega no frasco do produto meça o rendimento radioativo absoluto. Em seguida, use uma seringa blindada de chumbo para transferir 100 microliters do rastreador para um pequeno frasco para controle de qualidade.
Leve a amostra de controle de qualidade para uma área de trabalho de controle de qualidade protegida. Desenhe 40 microlitadores da amostra QC em uma seringa apertada a gás, carregue-a em um instrumento HPLC preparado equipado com uma coluna analítica e injete o produto. Realize outras medidas de controle de qualidade durante a execução do HPLC.
Uma vez terminado a execução do HPLC, integre todos os picos do cromatograma do detector de radioatividade para determinar se a pureza química do rádio SNAP é maior que 95% Integre os picos do cromatograma UV para determinar a pureza química do produto. Use a área sob o pico do produto UV para calcular a atividade específica. Uma vez confirmado o produto para atender aos requisitos de uso, libere o rastreador de rádio para o laboratório de experimentos cinéticos em tempo real.
Pelo menos 30 minutos antes do experimento lavar o tipo selvagem preparado ou células transfectadas com DPBS e adicionar dois mililitros de meio de crescimento livre de soro. Para bloquear as células transfeinadas adicione 0,98 microlitres de uma solução de 20,4 milimonas de cloridrato de verapamil racial em sulfóxido de dimetil. Incubar as células em um avião oblíquo por 30 minutos.
Em seguida, ligue o instrumento de ensaio em tempo real e o computador associado. Abra o software de controle e escolha um alvo. Defina o número de posições para duas, o tempo de detecção para três segundos, o tempo de atraso de detecção para dois segundos e o nome da primeira fase para a linha de base.
Insira o prato de cultura celular no suporte inclinado do dispositivo com o poste de célula na parte inferior. Certifique-se de que o polo celular está coberto em meio de cultura celular. Inicie uma medição de fundo de 10 minutos e defina o nome do arquivo e o caminho.
Defina a escala de tempo para minutos e a coleção de nuclídeos para carbono-11. Configure o gráfico para mostrar os dados de destino subtraídos de fundo, alvo e fundo. Uma vez que o rastreador de rádio tenha sido entregue e aprovado para uso, leve uma pequena amostra para o ensaio.
Calcule o volume necessário da solução de rastreador de rádio e prepare uma pipeta. No software de instrumento pausa a corrida e espere a rotação do prato parar. Abra a tampa do dispositivo, gire o suporte 90 graus para a esquerda, adicione o rastreador de rádio com a pipeta preparada e devolva o dispositivo à sua posição inicial.
Feche a tampa do dispositivo e retome imediatamente o experimento. Deixe o experimento funcionar por 20 minutos antes de acabar com ele. Processe e analise os dados para avaliar a absorção de SNAP nas células.
Agora, o procedimento pode ser repetido para o prato de cultura celular de controle tratado com DMSO e linha de células do tipo selvagem. Os ensaios cinéticos em tempo real foram realizados com células de tipo selvagem não-PGP expressando células do tipo selvagem, células expressas por PGP pré-bloqueadas com verapamil como inibidor de PGP e células PGP desbloqueadas. Não foi observada diferença significativa entre células não tratadas e células tratadas com veículos.
O SNAP de carbono-11 rapidamente se acumulou em células do tipo selvagem, enquanto nenhum acúmulo foi observado em células expressas em PGP. O pré-bloqueio do transporte efflux PGP com verapamil resultou em acúmulo de SNAP nas células PGP comparáveis à das células do tipo selvagem. Em combinação com as medidas cinéticas em tempo real, esta configuração permite uma ampla compreensão da farmacocinética de compostos de baixo peso molecular e, portanto, é altamente importante para o desenvolvimento pré-clínico de radiofarmacêuticos.
O tempo e a organização são os principais ingredientes para uma radiossíntese de carbono-11 bem sucedida com experimentos cinéticos subsequentes em tempo real, já que a meia-vida do carbono-11 é de apenas 20 minutos. Devido a uma curta meia-vida de carbono-11 muitas partes deste procedimento são realizadas simultaneamente. É importante que todos os envolvidos entendam o escopo e o tempo de seu papel.
Tanto a segurança do produto quanto a proteção contra radiação são fundamentais para a preparação de radiofarmacêuticos. Todos os experimentos devem seguir o tão baixo quanto razoavelmente alcançável ou princípio ALARA para limitar a exposição à radiação do operador.
