O objetivo geral deste procedimento é aprimorar os estudos secundários de pneumonia bacteriana, fornecendo uma rota simples e não invasiva de inoculação bacteriana para o trato respiratório inferior seguido de recuperação bacteriana e purificação do RNA para análise de transcrição. Isso será feito primeiro anestesiando um rato e inserindo uma agulha dobrada pré-carregada na traqueia de um rato que foi suspenso verticalmente dos incisivos maxilares. Em segundo lugar, após a infecção bem sucedida, as unidades formadoras de colônias bacterianas são recuperadas por excisão e homogeneização dos pulmões.
O homogenate pulmonar resultante é diluído em série e banhado em ágar nutriente para enumerar unidades formadoras de colônias. Por último, o RNA é purificado do homogeneizado pulmonar. A vantagem deste procedimento é que permite uma entrega controlada diretamente no trato respiratório inferior.
Isso nos permite olhar tanto para as contribuições combinatórias quanto individuais do patógeno para o desfecho da doença. Avanços recentes neste campo demonstraram que a regulação genética bacteriana pode ter um grande papel na determinação do resultado da infecção. Esta técnica se beneficia da capacidade de recuperar tanto cfus bacterianos quanto rna.
Uma vez que o RNA é isolado, podemos então avaliar as contribuições de genes específicos de virulência para a infecção. Além disso, essa técnica se beneficia de ser não-cirúrgico. Isso permite que o estresse mínimo seja colocado em todos os animais utilizados neste procedimento e permite que eles tenham uma recuperação imediata.
Este procedimento beneficia-se do uso de equipamentos de laboratório comuns sem o uso de qualquer tipo de cânulas, fios-guia ou cabos de fibra óptica. Indivíduos novos nessa técnica podem lutar no início com a instalação real através da traqueia. Uma vez que essa técnica é conceituada, torna-se um procedimento simples e eficaz para interrogar pneumonia bacteriana secundária dentro de um hospedeiro murino.
Antes de iniciar o procedimento, prepare o espaço de trabalho com os seguintes suprimentos: uma plataforma de intubação, uma seringa estéril de um mL, fórceps estéreis de ponta cega, agulha estéril de ponta bruta de 21 calibres e dois tubos cônicos para armazenar a seringa e fórceps. Inicie o procedimento preparando os inóculos patógenos para que a concentração final desejada seja obtida em um volume de 50 microliter. Em seguida, usando luvas estéreis prepare uma agulha de ponta cega de 1 a 1,5 polegadas, dobrando-a a um ângulo aproximado de 35 graus.
Depois de fixar a agulha na seringa, desenhe uma almofada de ar de 100 microlitres, seguida por 50 microliters do agente infeccioso. A almofada de ar de 100 microliter garante a entrega total da carga de patógenos uma vez que a seringa esteja deprimida. Coloque a agulha carregada e a seringa em um local facilmente acessível pela mão dominante.
Remova e anestesia o mouse da câmara de anestesia e suspenda o mouse na plataforma de intubação dos incisivos maxilares. Usando as fórceps de ponta cã, segure suavemente e estenda a língua. Transfira a língua dos fórceps para o polegar e o dedo indicador da mão nondominante.
Mantenha-se segurando a língua na mão nondominante e pegue a seringa pré-carregada. Aponte a ponta dobrada da agulha para longe do corpo. Insira a agulha na cavidade oral.
Na base da língua, o ângulo suavemente do pulso para causar um leve empurrão da agulha para longe do corpo. Esta ação garante que a agulha será inserida na traqueia e não no esôfago. Guie lentamente a agulha até a traqueia.
Muitas vezes um leve carrapato é sentido à medida que a agulha passa pela dobra vocal. Passe a agulha através da traqueia até que uma leve resistência seja sentida à medida que a agulha encontra a carina. Levante ligeiramente a agulha na direção ascendente para suspender a agulha acima da carina.
Isso permite a entrega nos brônquios primários. Deprimir totalmente o êmbolo da seringa para entregar a carga infecciosa. Retire a agulha da traqueia e descarte.
Remova o mouse da plataforma de intubação deprimindo o elástico, mas mantenha segurando o mouse na posição vertical. Obstrua as vias aéreas nasais colocando um dedo diretamente sobre as nares. Mantenha esta posição por aproximadamente um minuto ou até que várias respirações profundas sejam observadas.
Esta última etapa garante que o volume total do inóculo seja entregue no trato respiratório inferior. Devolva o animal para sua gaiola e garanta que haja uma pronta recuperação da anestesia. Em momentos selecionados, os pulmões infectados podem ser extirpados para quantificar e avaliar as contribuições bacterianas para as morbidades aumentadas associadas à pneumonia bacteriana secundária.
Prepare um espaço de trabalho com os seguintes itens: um barco de pesagem de escala e estéril, plataforma de dissecção, um kit de dissecção contendo tesouras e fórceps e gaze estéril. Para efeitos desta demonstração, a excisão dos pulmões será realizada em um banco superior. No entanto, a fim de manter a esterilidade durante este procedimento é recomendável que a excisão pulmonar seja realizada dentro de uma coifa de fluxo laminar.
Eutanásia um rato infectado com CO2 ou método similar aprovado pela IACUC de eutanásia. Coloque e proteja o mouse infectado na plataforma de dissecção. Pulverize o mouse com etanol para manter a esterilidade nas superfícies de trabalho.
Começando pelo umbigo, use um par de fórceps para levantar a pele e fazer uma incisão em direção à laringe. Agarrando a pele em ambos os lados da incisão inicial, puxe a pele para longe do corpo e corte as conexões teciduais. Pode ser útil fazer cortes laterais na pele para revelar mais da região torácica.
Começando na base do processo xifoide, faça uma pequena incisão com a intenção de perfurar o diafragma. Isso resulta em um aumento da pressão na cavidade torácica fazendo com que os pulmões se retraem. Com os pulmões retraídos, continue a incisão para liberar o diafragma.
Remova as costelas fazendo uma incisão em ambos os lados. Isso vai expor a cavidade torácica e os pulmões. Para extirfar os pulmões agarre a base do coração com os fórceps e levante para cima.
Coloque a tesoura atrás dos pulmões e comece a fazer pequenas incisões através das conexões teciduais enquanto continua a levantar o coração para cima. Uma vez que os pulmões tenham sido excisados, coloque-os sobre uma gaze estéril e remova o coração, levantando-o para longe dos pulmões e cortando as conexões de tecido restantes. Transfira os pulmões para o barco de pesagem pré-piche e registe a massa.
Depois que os pulmões tiverem sido pesados, transfira os pulmões para um soro fisiológico estéril tamponado e guarde-os temporariamente no gelo. Agora que os pulmões foram extirpados e pesados, as bactérias podem ser recuperadas para determinar seu papel na patogênese. Em preparação para a recuperação bacteriana, serão necessários os seguintes suprimentos: um moedor de tecido, PBS livre de RNase estéril, RLT tampão complementado com beta-mercaptoetanol e tubos de microcentrifuge sem RNase de 1,5 mL.
Comece adicionando primeiro um mL de PBS livre de RNase estéril ao moedor de tecido. Uma vez preenchido, guarde o moedor de tecido no gelo. Em seguida, prepare uma série de tubos de diluição serial estéreis sem RNase para quantificar a carga bacteriana recuperada dos pulmões infectados.
Transfira os pulmões para o moedor de tecido preparado e homogeneize completamente o tecido pressionando o pedestal durante a rotação. Abra o moedor de tecido e alíquota de 100 microliters da amostra homogeneizada no primeiro dos tubos de diluição serial preparados. Diluir em série as amostras e a placa em ágar de nutrientes para enumerar as unidades formadoras da colônia.
As UFC podem ser registradas como UFC por mL ou UFC por mL, por miligrama de tecido pulmonar. Após a retirada da alíquota de 100 microliter, substitua o pedestal de moagem e centrífuga a amostra a 4.000 rpm por 10 minutos a quatro graus Celsius. Quando a centrifugação estiver completa, remova o sobrenatante da amostra pelleted.
O supernante pode ser salvo e armazenado a menos 80 graus Celsius para análise posterior. Suspenda a pelota de tecido homogeneizado em 700 microliters de beta-mercaptoetanol RLT e transfira a amostra para um tubo de centrífuga de 1,5 mL livre de RNase estéril. Neste ponto, a amostra pode ser armazenada a menos 80 graus.
O RNA pode ser purificado a partir do chorume homogeneizado pulmonar RLT carregando a amostra em um tubo de microcentrifuge de dois mL contendo contas de sílica de 1 milímetro e processado através de um batedor de contas por 20 segundos a seis metros por segundo. O RNA é então imediatamente purificado usando uma adaptação do método RNeasy, como relatado em Voyich, et al. Métodos em Biologia Molecular"2008, e descrito no manuscrito que acompanha este vídeo.
Após a purificação, o rendimento do RNA pode ser quantificado usando um espectrômetro. Uma vez quantificado, é benéfico diluir o RNA resultante em várias alíquotas de 50 nanogramas por microliter. Isso permite que o RNA da amostra seja usado para múltiplas análises sem estar sujeito a múltiplos ciclos de congelamento.
O uso desta técnica permite a instalação de uma carga de patógeno controlada diretamente no trato respiratório inferior. A eficiência deste sistema de entrega pode ser demonstrada através da instalação de uma solução azul brilhante de 1%Coomassie. A linha superior exibe um par de pulmões não infectados para servir como controle, enquanto a linha inferior exibe um par de pulmões que receberam 50 microliters do corante azul brilhante 1%Coomassie através de uma instalação intratracheal.
O uso deste corante demonstra como a instalação intratracheal fornece uma distribuição uniforme da carga de patógenos dentro e em todos os pulmões esquerdo e direito. Uma vez infectada, a carga do patógeno pode ser recuperada e analisada em vários pontos de tempo pós-instalação intratraqueal por excisão e homogeneização do tecido pulmonar. Para demonstrar a eficiência desta técnica de recuperação, dois grupos contendo três camundongos cada foram infectados com uma dose baixa e alta de Staphylococcus aureus.
A entrada bacteriana foi banhada em ágar nutriente para enumerar CFUs. Uma hora após a instalação intratraqueal, os camundongos foram eutanizados, pulmões extirpados e homogeneizados em um moedor de tecido. O tecido homogeneizado foi diluído em série e banhado em ágar nutriente para enumerar CFUs.
O RNA isolado do tecido pulmonar homogeneizado pode ser examinado por transcriptase reversa PCR e usado para quantificar a abundância de transcrição relativa dos genes alvo. Para garantir uma contaminação mínima do DNA de fundo, recomenda-se que uma reação pcr, sem a adição de transcriptase reversa, seja executada juntamente com quaisquer reações qRT-PCR. Além das cargas bacterianas, essa técnica pode ser estendida à instalação e isolamento de cargas virais.
Após a homogeneização do tecido pulmonar, o RNA viral pode ser isolado e usado para medir a abundância de transcrição de genes virais ou construir uma curva padrão para quantificação viral. O uso deste sistema fornece um sistema altamente eficiente e reprodutível para estudar pneumonia bacteriana secundária. Uma vez dominado, este procedimento pode ser usado em experimentos em larga escala.
Trabalhando em lotes para eutanásia de camundongos, a instalação intratracheal pode ocorrer dentro de 30 segundos por mouse. Depois que isso for concluído, passando para a excisão dos pulmões, isso pode ser concluído em aproximadamente dois a três minutos por mouse. Embora os métodos aqui discutidos tenham sido no contexto de uma infecção bacteriana secundária, eles podem ser estendidos para qualquer procedimento onde uma entrega controlada e recuperação de um inóculo é necessário.
Além dos métodos aqui descritos, este procedimento pode ser complementado pela adição de uma lavagem broncoalveolar antes da excisão dos pulmões. Embora isso muitas vezes resulte em uma diminuição da carga de patógenos, beneficia-se da obtenção de dados, como análise de citocinas, atividade de desidrogenase lactato e identificação de diferentes populações celulares. Para obter uma compreensão mais completa da patogênese da doença, torna-se importante interrogar tanto as contribuições do hospedeiro quanto do patógeno para a doença.
O objetivo deste vídeo foi fornecer um método simples e eficiente para explorar pneumonia bacteriana secundária dentro de um hospedeiro murino.
