Como já sabemos, o microambiente tumoral é uma parte essencial do crescimento e invasão do câncer. Para imitar a progressão do carcinoma, precisamos de uma matriz tumoral humana biologicamente relevante. Esta é a única matriz tumoral humana baseada em ensaio de invasão in vitro.
Comparado com o ensaio esferoide clássico, este método não é tão sensível à temperatura e não requer transferência de esferoides. Esta técnica é adequada para amostras de câncer sólido derivadas do paciente, como carcinoma de cabeça e pescoço, e pode se estender para medicina personalizada, incluindo terapias de chemoradiação. Esta matriz baseada em tumor humano já foi usada para várias aplicações, incluindo testes de drogas de alto rendimento, análise de células vivas, cicatrização de feridas e ensaios de transferência.
O passo mais tecnicamente sensível é o manuseio do fibrinogênio pelo método, então você pode querer primeiro praticar esta etapa com poços vazios. É importante mostrar o manuseio adequado da matriz e é fácil de analisar mostrando o método visualmente. Para a geração de esferoides tumorais multicelulares, dispense uma vez 10 a 3 células da linha celular de interesse em 50 microliters de meio completo em cada poço de uma placa de fundo redondo de 96 poços ultra-baixos.
Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de cultura celular de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por quatro dias antes de confirmar visualmente a formação de esferoides tumorais com um microscópio invertido. Para configurar um ensaio de invasão esferoide tridimensional, descongelar a matriz humana derivada de myoma no gelo e descongelar a solução de estoque de fibrinogênio em um banho de água de 37 graus Celsius. Quando os reagentes tiverem aquecido, misture os volumes apropriados de matriz média e humana completa, trombina, aprotinina e fibrinogênio, adicionando o fibrinogênio pouco antes de distribuir a mistura matricial nas células.
Adicione imediatamente 50 microliters do gel resultante em cada poço da placa de cultura esferoide, direcionando a ponta para a parede interna de cada poço e desacelerando sem mover o esferoide do centro do poço. Uma vez que o fibrinogênio começa a gelar após alguns minutos, ele requer uma tubulação reversa robusta, mas precisa e o tratamento de apenas alguns poços de cada vez. Devolva a placa à incubadora de cultura celular por 30 minutos para permitir que o gel de fibrina de matriz derivado do mioma humano se solidifique antes de adicionar suavemente 100 microliters de meio completo ao topo de cada gel.
Então imagem a invasão esferoide diariamente. Para segmentação de imagens com ilastik, abra o software de classificação e segmentação de imagens de código aberto e selecione o fluxo de trabalho de Classificação de Pixel. Salve o projeto ilastik para o computador.
Os pixels serão classificados com base em anotações feitas pelo usuário. Clique em Dados de Entrada e Adicione novas para selecionar imagens para a análise. Para seleção de recursos, clique em Seleção de Recursos e Selecione Recursos.
Clique nas caixas apropriadas para selecionar os recursos de interesse. As caixas selecionadas ficarão verdes. Para um treinamento, clique em Treinamento.
Na seção Treinamento, deve haver dois rótulos, Label 1 e Label 2. Marque o fundo com um dos rótulos e marque as células com o outro rótulo. Quando todas as células e fundos dentro da primeira imagem tiverem sido rotulados, selecione a próxima imagem da visualização atual para continuar a marcar as células e o fundo até que 10% das imagens tenham sido marcadas.
Em seguida, selecione Atualização ao Vivo para analisar todas as imagens. Quando o treinamento for concluído e ilastik analisar todas as imagens, clique em Exportação de Previsão e selecione Segmentação Simples a partir da Fonte. Em seguida, selecione o formato de arquivo de saída desejado entre Escolher configurações de imagem de exportação e clique em Exportar Tudo para exportar os resultados da rotulagem.
Os arquivos serão exportados para a mesma pasta com as imagens originais. Para análise de área, primeiro abra a imagem original com uma barra de escala em Fiji ImageJ, tendo em conta que a imagem tem o mesmo tamanho e dimensão das imagens analisadas. Use a ferramenta de seleção de linhas para desenhar uma linha de um comprimento conhecido e clique em Analisar e Definir escala.
Em seguida, defina a distância conhecida no campo de distância conhecido. Defina a unidade adequada e clique em Global. Para instalar o plugin ilastik, clique em Ajuda e Atualização e clique em Gerenciar sites de atualização na janela de atualização ImageJ.
Clique ao lado de ilastik, Feche e Aplique alterações. Após vários minutos, uma janela de informações aparecerá dizendo atualizada com sucesso. Clique em OK e reinicie ImageJ.
Em seguida, clique em Plugins, Macros e Instalar e selecione o contador. arquivo ijm. Em seguida, clique em Abrir.
Para concluir a análise da área, clique em Plugins e role para selecionar ilastik. Selecione Importar HDF5 e selecione o arquivo com o formato h5. Clique em Abrir e Carregar e aplicar a tabela de procuração.
Em seguida, clique no botão A no teclado e a área aparecerá na janela de resumo como a área total. Neste experimento representativo, quatro dias após a semeadura da linha celular escamosa de células escamosas laríngeas metastáticas, a matriz foi adicionada aos esferoides formados como demonstrado e a invasão foi monitorada diariamente em um microscópio invertido. Uma vez incorporadas, as células da matriz fibrina derivada do mioma humano começaram a invadir rapidamente após um dia e se estenderam para a matriz nos dois dias seguintes.
As células da matriz derivada do sarcoma do rato não invadiram a matriz circundante, em vez de formar uma estrutura assimétrica. As células do colágeno invadiram ligeiramente, mas devido ao encolhimento matricial a análise tornou-se difícil. Em alguns poços, os esferoides até desapareceram depois de três dias.
Aqui, a quantificação da invasão de uma célula de carcinoma celular laríngeo metastática e metastática na matriz fibrina derivada do mioma humano é mostrada. A análise de células vivas da invasão esferoide da matriz fibrina derivada do mioma humano revela o movimento celular em fios em toda a matriz que é seguido por outras células ao longo do tempo. Lembre-se de ter cuidado para não mover o esferoide da posição central ao adicionar a matriz aos poços.
Este procedimento pode ser usado para estudar como a irradiação e moléculas específicas, como drogas cancerígenas, afetam a invasão. As células podem ser fixadas e manchadas para estudos subsequentes. No modelo clássico de sarcoma do rato, as células proliferam principalmente e o aspecto de invasão é mínimo.
Esta matriz baseada em tumor humano induz a invasão, tornando os estudos de inibição mais eficientes.
