Este método mede os níveis do ppGpp regulador global em diferentes condições de crescimento e situações de estresse. O PpGpp pode ser encontrado em bactérias gram positivas e negativas, bem como em cloroplasto. PpGpp tem um início rápido em segundos, o que leva a uma segunda relação rápida uma vez que o estresse é produzido.
Simultaneamente, tem uma meia-vida curta, até 30 segundos. Portanto, há a necessidade de monitorar muitas culturas em intervalos de tempo que podem variar de 10 segundos para horas, incluindo transições estressadas. Também as culturas bacterianas radiolabel em pratos de microtústria facilitam amostras de alto rendimento que permitem múltiplas réplicas técnicas e biológicas.
Certifique-se de seguir as medidas de segurança adequadas ao trabalhar com materiais radioativos. Para iniciar este procedimento, prepare todos os meios de comunicação conforme descrito no protocolo de texto. Cresça culturas durante a noite na mídia MOPS com três fosfato de sódio milimila.
Adicione 550 microliters de mídia MOPS, contining 0,2 micromolar portador de fosfato de sódio e 30 microliters de cada inóculo bacteriano aos poços de uma placa de 24 poços. Isso resultará em um inóculo inicial com um OD600 de 0,1. Adicione mídia fresca a um bem como um controle de esterilidade.
Coloque a placa em uma incubadora de agitação a 37 graus celsius, tremendo a 900 RPM por 30 minutos. O crescimento pode ser monitorado usando um leitor de placas com uma placa de réplica em paralelo na mídia sem p32 usando um leitor de placas enquanto incuba sob as mesmas condições. Em seguida, adicione 100 microcurias de ortopofas p32 a cada poço da placa.
Cresça as culturas em uma incubadora de agitação para uma a duas duplicações para permitir que o rótulo externo se equilibre em grande parte com piscinas de nucleotídeos intercelulares. Para visualização adequada, nenhum material ativo foi utilizado neste vídeo. Em um experimento real, é necessária uma blindagem adequada, bem como monitoramento constante para contaminação com um medidor de pesquisa.
Primeiro, induzir o estresse usando um método apropriado para o tipo de estresse estudado. Em seguida, adicione 20 microliters de cada amostra celular rotulada a um tubo PCR separado de 0,2 mililitro, contendo 20 microliters de gelo frio seis molar ácido fórmico. Coloque imediatamente as amostras em gelo seco.
Aumente a eficiência de extração celular em três ciclos de congelamento e descongelamento. Pouco antes de detectar cromatogramas de camada fina de celulose PEI, centrifugar as amostras por um minuto a velocidade máxima para pelotas de detritos celulares. Primeiro, estabeleça uma placa TLC de celulose PEI de 20 por 20 centímetros.
Use uma tesoura para remover os cinco centímetros superiores. E use um lápis macio para marcar uma linha de origem a um centímetro da borda. Aplique uma gotícula de cinco microliter de cada amostra à superfície PEI.
Antes que a mancha possa secar, transfira a placa para um tanque contendo uma camada de fosfato de monopotássio molar de 1,5 molar que é raso o suficiente para não tocar no ponto de amostra de origem. Cubra o tanque com uma vedação hermética e permita a subida líquida até a parte superior da folha de 15 centímetros aparada. Depois disso, remova o cromatograma totalmente desenvolvido e o ar seque-o à temperatura ambiente.
Corte e descarte a porção superior do cromatograma contendo o P32 livre em resíduos radioativos. Use uma tela de fósforo para expor os filmes audioradiográficos durante a noite. No dia seguinte, desenvolva o filme e use um fósforo para capturar e quantificar o sinal verde do fósforo.
Em seguida, use o software ImageJ para quantitar os pontos radioativos. Depois de provocar estresse ou fome por tempo suficiente para permitir o acúmulo de ppGpp, use um método apropriado para reverter o estresse. Pegue amostras a cada 20 a 30 segundos por até dois minutos e processe as amostras como descrito anteriormente.
Uma vez que o TLC é desenvolvido, e os níveis de ppGpp são obtidos durante o curso de tempo, plote o conteúdo residual ppGpp em um plot semilogarithmic versus tempo. Neste estudo, as células cultivadas em MOPS contendo todos os aminoácidos, exceto o ILV, são rotuladas com P32. Uma vez rotulada, L valine é adicionada para produzir isoleucina fome.
Após cinco minutos, ocorreu um aumento de dois e dois anos e meio nos níveis de tetra e pentafosfato de guanosina. Um controle negativo de uma amostra rotulada livre de células é usado para detectar possíveis compostos que não são ortofosfato na fonte P32. A reversão da fome de isoleucina pode ser alcançada pelo clororamfenicol, um inibidor da síntese proteica, que reduz o consumo de tRNA isoleucina carregada, e, por sua vez, restaura altas proporções de tRNA carregado a não carregado.
A ativação da forte síntese de ppGpp mediada por rerelação é abolida, o que permite uma medida de degradação do ppGpp sem perturbação pela síntese residual. Neste caso, ppGpp decai com uma meia-vida de aproximadamente 64 segundos. É importante deixar as células crescerem por algumas gerações para alcançar uma rotulagem uniforme antes de induzir qualquer estresse ou fome.
Como o ppGpp é amplamente disseminados entre as bactérias, este método pode ser aplicado a outros organismos. A modificação do método de desenvolvimento do TLC poderia permitir a separação adequada de todos os nucleotídeos regulatórios, como o ppApp. P52 é um isótopo emissor melhor, por isso é importante usar a blindagem adequada e descartar adequadamente qualquer resíduo.
