Os autores agradecem aos colegas e funcionários de laboratórios presentes e passadas que têm apoiado o desenvolvimento desta técnica. Laboratório de SP é apoiado pelo Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde Grant operacional MOP-84473 e Alberta Soluções Inova-Saúde (financiados pela Fundação Alberta Heritage para Fundo de Doações de Pesquisa Médica). DP de foi apoiado pelo National Institutes of Health concede MD001091-01 e GM068855-02.

1. Preparação de culturas bacterianas, Ferramentas e Reagentes (dia 1, Tarde) <ol><li> No final da tarde, inocular 1-5 ml de caldo LB autoclavado em estéril (por exemplo, 100 x 13 mm) tubos de ensaio de vidro de borosilicato com uma pequena alíquota de bactérias (E. coli ou V. cholerae). </li><li> Defina os tubos de ensaio inoculados em um tambor rolo alojados a 37 ° C de temperatura (sala quente ou incubadora), ligue o tambor rolo em alta velocidade, e incubar O / N. </li><li> Preparar um espalhador de célula na forma de um &quot;stick de hóquei&quot; de uma vareta de vidro por aquecimento do meio da haste na chama de um bico de Bunsen, até o vidro amolece e, em seguida, dirigir a curva suavemente com uma pinça ou um alicate em um ângulo de 135 ° . Aquece-se a haste de, mais uma vez, no ponto médio entre a extremidade e a primeira curva e dobrá-lo em um ângulo de 45 ° para dentro (no sentido oposto ao da primeira curva). </li><li> Prepare LB-agar sem antibióticos e despeje em placas de Petri, em preparação daprotocolo electrocompetence, e LB-agar placas contendo o antibiótico apropriado (de acordo com o marcador de resistência no vector a ser electroporada), e armazenar a 4 ° C. </li><li> Preparar um filtro esterilizado de CaCl 2 a 2 mM para a solução de V. cholerae, ou autoclave DDH 2 O para E. coli, e armazenar a 4 ° C. </li></ol> 2. Crescimento de electrocompetentes Bactérias (DIA 2, Manhã) <ol><li> Entregar 100 ul da cultura bacteriana S / N em cada placa de agar LB, os estoques de glicerol congelados podem também ser utilizados e entregue directamente sobre a placa. </li><li> Mergulhe o hóquei em forma de bastão espalhador de celular em 100% EtOH, escorra rapidamente e queimar o restante EtOH para esterilizar antes do uso e disseminação. Espalhe a cultura bacteriana 100 l O / N uniformemente com o espalhador célula de vidro estéril tomando cuidado para não perturbar (break) a superfície do ágar. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C durante 4-6 horas, ou até que um relvado fina de crescimento bacteriano servem distinguíveis. As células são mais competente quando crescendo ativamente. </li></ol> 3. Preparação de electrocompetentes bacterianas Cells (dia 2, à tarde) <ol><li> Colha as bactérias com uma ansa de inoculação estéril tomando cuidado para não furar ou quebrar a superfície do ágar. Uma massa bacteriana 2 mm de diâmetro é suficiente para uma única transformação. Tipicamente, isto requer a raspagem da superfície da relva fina com a ansa de inoculação de duas ou três vezes. Várias amostras (normalmente entre 4-6) podem ser recolhidos a partir do mesmo prato. </li><li> Ressuspender a massa bacteriana em 1 ml de gelado 2 mM de CaCl2 (para V. cholerae) ou estéril ddH2O (para E. coli) e misture bem até que não são visíveis aglomerados, manter em gelo. </li><li> Centrifugar cada suspensão bacteriana durante 5 min a 5000 x g numa microcentrífuga refrigerado ajustado para 4 ° C, ou em uma microcentrífuga armazenada num quarto frio para definir a 4 ° C. </li><li> Desprezar o sobrenadante, resuspterminar o sedimento bacteriano no mesmo volume de 2 mM de CaCl 2 gelada ou ddH2O estéril, e repetir a etapa de centrifugação, tal como feito antes de mais duas vezes para um total de três lavagens. </li><li> Remover o sobrenadante, ressuspender, e em seguida soltar a pelota bacteriana completamente em 40 mL de gelo frio de 2 mM de CaCl2 ou estéril ddH2O e manter em gelo. </li></ol> 4. Transformação de electrocompetentes Bactérias (dia 2, à tarde) <ol><li> Adicione-se a 1 ug de DNA de plasmídeo (até 1 uL de água ou solução tampão de Tris-EDTA) a suspensão bacteriana e transferir 40 ul desta mistura num pré-gelada, estéril cuvete 0,2 centímetros lacuna. A concentração de sal na amostra de DNA deve ser acessível a, uma vez que irá contribuir para a formação de arco do pulso no passo seguinte. </li><li> Coloque a célula para a câmara de eletroporação do módulo de controle de pulso, e electroporate em 1,8 kV, 25 mF. A constante de tempo deve ser ~ 5.0 ms, e nenhum arco deve ocorrer. </li><li> Recuperar rapidamente a suspensão de células por ressuspensão em 1 ml de caldo LB e transferir para previamente autoclavada tubo de vidro de borosilicato. </li><li> Permitir que as células para recuperar por incubação sob condições de crescimento gaseificadas (num tambor de rolos), a 37 ° C durante 30 min sem selecção de antibiótico. </li><li> Placa as bactérias em placas de agar LB previamente preparadas na presença do agente selectivo apropriado (antibiótico), e incuba-se a 37 ° CO / N. Se as bactérias são transformadas com uma elevada concentração de vector purificado (0,1-1 ug de plasmídeo super-enrolado), volumes 10 mL de cultura bacteriana sobre a borda da placa de agar LB e com uma sequência de ansa de inoculação estéril para colónias isoladas usando o método de sequência de quadrante. Se uma mistura de ligação foi transformada, entregar 100 ml de cultura bacteriana em cada placa de ágar e espalhar uniformemente com o espalhador de célula de vidro esterilizado. </li></ol> a Se a constante de tempo é curto (serbaixo 3,5 ms), ou pulsação leva a formação de arco eléctrico, em seguida, re-precipitar o ADN da amostra, lava-se com EtOH a 70%, duas vezes para remover sais antes da secagem e ressuspensão em tampão TE.

<ol>
	<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation.">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Res. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li><li>Taketo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transfection+of+Escherichia+coli+by+electroporation.">DNA transfection of Escherichia coli by electroporation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 949 (3), 318-324 (1988).</li><li>Fiedler, S., Wirth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+bacteria+with+plasmid+DNA+by+electroporation.">Transformation of bacteria with plasmid DNA by electroporation.</a> Anal. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+electroporation+and+cloning+vector+system+for+gram-positive+bacteria.">Improved electroporation and cloning vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 57 (4), 1194-1201 (1991).</li><li>Micheletti, P. A., Sment, K. A., Konisky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+coenzyme+M-auxotrophic+mutant+and+transformation+by+electroporation+in+Methanococcus+voltae.">Isolation of a coenzyme M-auxotrophic mutant and transformation by electroporation in Methanococcus voltae.</a> J. Bacteriol. 173 (11), 3414-3418 (1991).</li><li>Schleper, C., Kubo, K., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+particle+SSV1+from+the+extremely+thermophilic+archaeon+Sulfolobus+is+a+virus:+demonstration+of+infectivity+and+of+transfection+with+viral+DNA.">The particle SSV1 from the extremely thermophilic archaeon Sulfolobus is a virus: demonstration of infectivity and of transfection with viral DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (16), 7645-7649 (1992).</li><li>Aune, T. E., Aachmann, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+to+increase+the+transformation+efficiencies+and+the+range+of+bacteria+that+can+be+transformed.">Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed.</a> Appl. Microbiol. 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Não há divulgações são aplicáveis.

A eficiência de transformação é sujeito a uma variedade de fatores, independentemente do método utilizado para preparar as células competentes. Variáveis ​​análogas são aplicáveis ​​a este método, um grande cuidado deve ser tomado para que uma vez que as células são colhidas a partir da placa de agar tal que eles são mantidos a baixa temperatura constante (não superior a 4 ° C). A camada de bactérias deve ser activamente crescente no momento da recolha, as células devem estar em fase semi-logarítmica de crescimento. Qualidade do ADN (isto é, a contaminação de sais) influencia a eficiência de transformação. Especificamente, quando se emprega este método, o ágar não deve ser quebrado como fragmentos de agar na cuvete irá causar faíscas do pulso. A maioria dos problemas encontrados com esta técnica está associada com dois problemas, recolhendo as bactérias durante a janela de tempo apropriada da placa de agar, quando eles estão em crescimento activo. Coletá-los muito em breve trará o número de células insuficientes e irá processar araspando a placa de agar LB frustrante porque o &quot;pellicule&quot; formam é difícil de levantar para fora da superfície da placa. Bactérias Coleta tarde vai diminuir drasticamente a sua competência. A janela de tempo irá variar, naturalmente, dependendo da densidade de inoculo semeado em placas de agar LB. O segundo passo essencial é a de manter as bactérias frio (4 ° C) a partir do momento em que eles são levantados para fora da placa de ágar e ressuspensas em CaCl 2 ou ddH2O até serem semeadas em agar LB transformação seguinte. Os tubos de microcentrífuga contendo as bactérias, cuvetes e tampão deve ser pré-arrefecido e mantido em gelo para todas as vezes até que as bactérias são plaqueadas. No entanto, problemas adicionais podem surgir quando a estéril ddH2O ou CaCl2 conter precipitado ou contaminados. Por este motivo, recomendamos a elaboração deste novo reagente. Solução de problemas de transformação é facilitada pela inclusão de controles ao transformar bacteria prestados competente por qualquer método. Um controle negativo constituído por um grupo de bactérias competentes não transformadas semeadas em uma placa de ágar LB contendo o marcador selectivo irá ajudar rapidamente determinar se o antibiótico na placa é eficaz. A transformação do controlo positivo com uma preparação plasmídeo conhecido de boa qualidade e quantidade abrigar o mesmo marcador seletivo como a amostra experimental será útil para determinar se as bactérias são competentes, mas também se o DNA experimental transformada foi suficiente em quantidade ou qualidade. As vantagens desta técnica são múltiplos, o método pode ser realizado no mesmo dia em que a transformação é planejado. Nós descobrimos que o estoque de glicerol bacteriana congelado pode ser banhado diretamente sobre o agar LB sem qualquer perda na electrocompetence, temos feito isso em situações de &quot;emergência&quot; (depois de esquecer de iniciar a cultura durante a noite do dia anterior). Embora não pudemos testar emuito estirpe conhecida, qualquer E. coli ou V. cholerae tensão que pode ser transformado por eletroporação tem sido favorável a este protocolo em nossas mãos. A técnica é rápida, eficaz e produz eficiências de transformação comparáveis ​​aos obtidos desde a preparação bactérias electrocompetentes empregam métodos tradicionais. O método elimina a necessidade de centrífuga de alta velocidade e de rotores associados, num agitador orbital incubadora e baldes de centrífuga estéreis (recipientes), e grandes volumes de tampão autoclavado. Embora a tabela de reagentes específicos e Equipamentos é bastante abrangente, a maioria dos laboratórios que realizam eletroporação terá a maioria, se não todos, estes materiais já disponíveis. Talvez o mais importante, a técnica pode ser facilmente aplicado para gerar estirpes electrocompetentes específicos do laboratório com fundos mutantes rapidamente. Não temos conhecimento de quaisquer limitações desta técnica, uma vez que substituiu o método tradicional de preparação de electrocompetent bactérias nos nossos laboratórios. Os resultados de nossas experiências mostradas aqui foram realizados com células electrocompetentes frescos produzidos com o método tradicional, que tinha sido armazenado a -80 ° C durante não mais de 1 semana. No entanto, os estoques de células congeladas electrocompetentes de perder competência e viabilidade ou durante longos períodos de armazenamento. O protocolo simplificado permite a preparação de células electrocompetentes fresco no mesmo dia da transformação está prevista, sem preocupações com a idade do material, que podem resultar em rendimento transformante diminuiu. Não tentamos armazenar células electrocompetentes produzidos usando o método rápido para uso em outro dia, pois isso não foi necessário. Embora não seja mostrado aqui, a eficiência das células electrocompetentes preparadas utilizando o nosso método rápido é suficiente para misturas de ligação. As transformações relatados para não-O1 V. cholerae em um recente artigo de Unterweger et al.17 foram realizados com bactérias electrocompetentes preparadas pelo método descrito aqui (exceto as realizadas por conjugação). Esta técnica permite aos pesquisadores transformar cepas mutantes com fundos rápida e eficazmente sem ter que preparar grandes quantidades de células. Este método de preparação rápida de bactérias electrocompetentes pode ser adaptado para outros procariotas que foram mostrados para ser passível de electroporação, como o princípio da preparação e as definições de eletroporação vão ser as mesmas que as de protocolos tradicionais.

Desde a sua &#39;criação no início dos anos 1980 1, eletroporação tornou-se uma técnica de biologia molecular integral, provavelmente, o único método mais comum empregado para transformar / transfectar células vivas com ácidos nucléicos circulares ou lineares. Desenvolvida originalmente para a transfecção de células eucarióticas 1, electroporação foi subsequentemente adaptado para a transformação de E. coli 2, 3. Em bacteriologia, electroporação tornou-se o padrão de laboratório e foi modificado para transformar uma vasta gama de bactérias, incluindo bactérias Gram-negativas Pseudomonas 4, 5 Salmonella, Vibrios 6, Serratiae, e bacilos disentéricos 7; Clostridia Gram-positivos 8, Bacilos 9, 10 Lactobacilos e enterococos 11. Mesmo algumas arqueobactérias provaram susceptível à transformação por electroporação, incluindo Methanococci </em&gt; 12 e 13 Sulfolobus espécies. Para uma revisão abrangente consulte Aune e Aachmann 14. Eficiência de transformação por eletroporação é declaradamente 10-20 vezes maior do que a competência química ou choque térmico 2. No entanto, assim como a preparação de bactérias para a competência química como otimizado por Douglas Hanahan na década de 1980 15, as células também deve estar preparado para ser electrocompetentes. Eletroporação é um meio rápido e eficaz de transformação bacteriana, exigindo bactérias electrocompetentes, DNA purificado, um módulo de controle de pulso que fornece o impulso elétrico, e uma câmara que acomoda pequenas células descartáveis, que funcionam como um eletrodo. Resumidamente, as bactérias competentes frias, são misturados com o DNA de plasmídeo, submetido a um impulso de alta tensão numa cuvete, ressuspensas em meio de crescimento, incubadas a 30-37 ° C durante 30-45 min, e, em seguida plaqueadas em meio semi-sólido (agar nutriente placas), com a aproxopriate antibiótico seletiva. Em contraste com o passo de condicionamento, a preparação de electrocompetentes E. coli continua a ser um processo de várias partes que tradicionalmente é realizado em grandes volumes. Resumidamente, uma cultura durante a noite de bactérias é inoculado num balão de Erlenmeyer com 100 ml a 1 litro de Luria Broth (LB), crescidas até à fase semi-logarítmica de crescimento (DO600 de &lt;1,0), e sujeitos a lavagens em série com um não estéril iónico tampão ou água bidestilada (ddH2O), em uma redução dos volumes a 4 ° C. Grande cuidado deve ser tomado para manter as células frio durante todo o procedimento e evitar a contaminação. Isto requer a utilização de baldes centrifugação autoclavados e tampões não-iónicos ou ddH2O, uma incubadora agitador orbital, um volume grande de alta velocidade centrífuga refrigerada e um conjunto de rotores. As bactérias são finalmente ressuspensas num pequeno volume de tampão suplementado com 10% de glicerol e divididas em alíquotas para ~ 40 volumes ul, which são armazenadas a -80 ° C até à sua utilização. De armazenamento a baixa temperatura, muitas vezes resulta em eficiências de transformação diminuiu, devido à perda de viabilidade ao longo do tempo. Células bacterianas electrocompetentes estão também disponíveis a partir de uma variedade de fontes comerciais, mas apenas para um número limitado de (frequentemente recombinação deficiente) E. coli como hospedeiros vulgarmente utilizados para propagar uma vasta gama de plasmídeos. Como resultado os pesquisadores contam com métodos in-house para preparar as suas próprias linhagens / mutantes para a transformação. Um suplente, protocolo rápido e eficiente para a preparação de electrocompetentes E. coli tem sido usada por alguns laboratórios de bacteriologia molecular por algum tempo e agora foi estendido para as bactérias Gram-negativas adicionais, no nosso caso V. cholerae. O criador do protocolo não pode ser identificado, pois foi otimizado por outros pesquisadores ao longo do tempo. O método aqui apresentado foi usado no nosso laborats por quase duas décadas, e é nosso objetivo de compartilhar esse protocolo útil com nossos pares.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Module</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2668</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Cuvette Chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2669</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocuvettes (0.2 cm gap)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 x 100 mm Pyrex Rimless Culture Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>70820-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mm Culture Tube Closures</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04500-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 x 250 mm Glass Rod</td>
			<td>Lab Source</td>
			<td>11381D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum Motor Assembly</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-4004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Drum for 13 x 100 mm Culture Tubes</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1053-0306</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>C5670</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous/denatured</td>
			<td>Sigma Chemicals</td>
			<td>227649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating Loop</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>MP182-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Microcentrifuge 5451 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621425</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-917Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth MILLER</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.10285.0500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25127</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid protocol for preparation of electrocompetent escherichia coli and vibrio cholerae

A electroporação tornou-se um método amplamente utilizado para rapidamente e eficientemente a introdução de ADN estranho em uma ampla variedade de células. Eletrotransformação tornou-se o método de eleição para a introdução de ADN em procariotas que não são naturalmente competente. A electroporação é um método de transformação rápida, eficiente, e simplificada, que, além de ADN purificado e bactérias competentes, requer disponível comercialmente controlador de impulsos de genes e tinas. Em contraste com o passo de condicionamento, a preparação de células electrocompetentes é moroso e de trabalho intenso que envolve ciclos repetidos de centrifugação e lavagens com uma redução dos volumes de água esterilizada, fria, ou tampões não-iónicos de grandes volumes de culturas cultivadas até à fase semi-logarítmica crescimento. Tempo e esforço podem ser salvas através da compra de células electrocompetentes de fontes comerciais, mas a seleção é limitada a comumente empregada E. estirpes laboratoriais coli. Estamos aqui divulgando uma rápida emétodo eficiente para preparar electrocompetentes E. coli, o que tem sido utilizado por laboratórios de bacteriologia por algum tempo, pode ser adaptado para V. cholerae e outros procariotas. Embora não possamos saber quem ao crédito para o desenvolvimento da técnica original, estamos aqui tornando-o disponível para a comunidade científica.

Foi realizado um conjunto de transformações com E. coli e V. cholerae para comparar a eficiência de transformação da nossa metodologia rápida com uma adaptação do método (tradicional) originalmente descrito por Dower et al. 2 para a preparação de bactérias electrocompetentes. Para levar a cabo a preparação tradicional de células competentes, 500 ml de LB num balão Erlenmeyer de 2 L-foram inoculados com 500 ul da cultura durante a noite de E. coli DH5a ou V. cholerae O395, incubadas num agitador orbital (215 rpm, a 37 ° C) e colhidas em OD 600 de entre 0,5-1,0. O frasco foi arrefecido em gelo e as culturas centrifugada num rotor pré-refrigerada a 4000 xg durante 10 min a 4 ° C. As pelotas de células foram cuidadosamente ressuspendidas em 500 ml de 2 mM de CaCl 2 gelada para V. cholerae e DDH 2 O para E. coli, e centrifugado novamente nas mesmas condições. Rodadas subsequentes de uma ressuspensãod centrifugação foram realizados em uma redução dos volumes de 200 e 100 ml volumes certificando-se a cultura permaneceu refrigeradas a 4 ° C. Finalmente, uma ressuspensão e centrifugação num volume de 10 ml foi efectuada com 10% de glicerol. O sedimento final foi ressuspenso em 2 ml de glicerol a 10% e 40 mL alíquotas foram congeladas a -80 ° C e não armazenado do que uma semana antes da electroporação. Condições de eletroporação incluindo as configurações de tamanho de pulso e tina foram idênticos para as duas espécies de bactérias em todas as electroporations independentemente do método de preparação das células competentes. A única diferença foi que realizou as lavagens em DDH 2 O frio para E. coli e frio mM CaCl 2 2 para V. cholerae. Tabela 1 mostra os resultados de bactérias transformadas por electroporação de forma idêntica, mas tornadas competentes ou com o protocolo rápido ou com o método tradicional. Nós empregamos O395 tensão e DH5ct tão comumutilizados ly, estirpes representativas de V. cholerae e E. coli, respectivamente, com resultados semelhantes podem ser obtidos com outras estirpes da mesma espécie (embora não a cada estirpe foi testado) e susceptível adaptado para outras bactérias gram-negativas e, provavelmente, mais além. Para garantir que os números de células iguais estavam presentes em cada lote pulsada, bactérias electrocompetentes gerados utilizando o método rápido foram reunidas após a recolha, misturada, mantida de forma homogénea em suspensão, e aliquotado em 40 volumes ul imediatamente antes da electroporação. Bactérias electrocompetentes gerados utilizando o método tradicional foram tratados da mesma forma antes de congelar em 40 mL alíquotas. Após a entrega do impulso, de cada lote de 40 uL de bactérias electroporadas foi suspensa em 400 ul de LB e diluída em série 1:10. Cem microlitros de cada diluição em placas em agar de LB na presença de 100 ug / ml de ampicilina e espalhar usando um espalhador de vidro estéril de célulase incubou-se a 37 ° C durante a noite. Para quantificar o número total de bactérias empregues em cada transformação, 40 volumes ul de bactérias electrocompetentes de cada lote preparado foram diluídas em série e plaqueadas em agar LB sem antibióticos de forma idêntica em paralelo. Uma alíquota de bactérias igualmente tratados, de cada lote foi electroporada com 1 ul de Tris-EDTA (TE) de tampão, mas sem DNA (transformação simulada), diluídos em série e plaqueados em agar LB sem antibióticos para estimar o número de células perdidas pela entrega do pulso elétrico. Por último, uma variação adicional de que o experimento foi realizado para determinar se as incubações 30 min a 37 ° C em 1 ml de LB após a electroporação, mas antes do plaqueamento em placas de LB-agar que afectam a recuperação de células transformadas. unidades formadoras de colônia (CFUs) foram enumerados no dia seguinte. Para esta experiência utilizou-pUC18, um plasmídeo de laboratório comuns, e os lotes de bactérias competentes consistindo de umpproximately 10 8 CFU para células preparadas utilizando o método tradicional e 10 7 CFU para células preparadas utilizando o protocolo rápido. Eletroporação sozinho (sem DNA) reduziu UFC viáveis ​​por 10-100 vezes, independentemente do método utilizado para preparar as células electrocompetentes. Como mostrado na Tabela 1, o rendimento era transformante na 10 6 -10 7 CFU / ug de ADN gama de três experiências em replicado (desvios padrão entre parêntesis) para E. coli (DH5a) e V. cholerae (O395), respectivamente, utilizando o método tradicional, mais longas para a preparação de células electrocompetentes. Rendimento transformante apareceu diminuiu de 10 vezes a 10 5 a 10 6 UFC / mg de DNA em três experimentos replicados (desvio padrão entre parênteses) para E. coli e V. cholerae, respectivamente, usando o método rápido. Por essa razão, determinou a percentagem de bactérias transformadas pela divisão UFC transformadospelo número de UFCs recuperado de &quot;transformações&quot; simulados (sem plasmídeo) de lotes idênticos de células competentes. A percentagem de bactérias transformadas foi dentro de um log (2,5-9,4%), independentemente do método de preparação e as espécies transformadas (Tabela 1 Os números entre parênteses). Estes resultados sugerem que a eficiência do método rápido é comparável ao do processo tradicional de preparação demorado células competentes e que as estirpes representativas de Vibrio cholerae e Escherichia coli são igualmente receptivo ao processo rápido. Descobrimos que a eficácia de transformação, para os plasmídeos tais como pUC18 abrigando cassetes β-lactamase, não é afectada pelo tempo de recuperação de 30 minutos em meio líquido LB. O mesmo número de transformantes foi recuperada se as células em placas de agar LB na presença de ampicilina directamente, após a electroporação, ou se podiam um tempo de recuperação de 30-45 minem caldo LB a 37 ° C antes de plaqueamento. Nossos resultados que ampicilina-resistência não exige conseqüência sob condições não-seletivos sugere que a expressão β-lactamase ocorre suficientemente rápido sobre transformação. No entanto, deve notar-se que foram realizadas diluições em série de bactérias pulsados ​​em caldo LB, o que pode ter contribuído para a recuperação do choque eléctrico e iniciar a expressão do gene. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50684/50684fig1.jpg" /> Figura 1. Representação gráfica da metodologia para a preparação rápida de bactérias electrocompetentes. Após 4-6 horas (dependendo da densidade do inóculo) um número suficiente de bactérias pode ser recolhido para levar a cabo as transformações 4-6 a partir de uma única placa de agar LB. Para segurar um número igual de células competentes para cada volume final a ser electroporado, bactérias recolhidas a partir da placa de agar LB foram inicialmente recolhidos e lavados juntos então aiiquoted em 40 volumes ul, dependendo do tamanho da pastilha (peletes maiores foram diluídos em volumes maiores divisível por 40 ul). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Número de ADN transformantes / ug resistente à ampicilina (transformantes resistentes à ampicilina recuperada [%]) </td></tr><tr><td> Tensão </td><td> Método tradicional </td><td> Método rápido </td></tr><tr><td> E. coli (DH5a) </td><td> 2,3 x 10 6 (± 7,3 x 10 5) [9,4%] </td><td> 3 x 10 6 (± 7,1 x 10 5) [2,5%] </td></tr><tr><td> V. cholerae (O395) </td><td> 4 x 10 7 (± 1,7 x 10 7) [5%] </td><td> 6,7 x 10 5 (± 2,1 x 10 5) [3,3%] </td></tr></tbody></table> Tabela 1. A eficiência de transformação por micrograma de ADN (pUC18) de electrocompetentes bacteria preparado pelo método tradicional em comparação com o método rápido. Todas as transformações foram realizadas com 500 ng de pUC18 DNA (~ 80% do ADN super-enrolado, como visualizado através de electroforese em gel de agarose a 1%) e as células electroporadas foram diluídas em série de 10 vezes em caldo LB antes do plaqueamento para CFU em LB-ágar com antibióticos. Controles de bactérias não-eletroporados e de bactérias eletroporados sem plasmídeo, diluído em série e semeadas em agar LB sem antibióticos foram realizados para cada conjunto de transformações para determinar o número total de bactérias viáveis ​​antes e depois de pulsar. Os controles eletroporados representou a linha de base para a porcentagem de bactérias viáveis ​​transformados com sucesso.

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Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

A electroporação é um método vulgarmente utilizado para a introdução de ADN em bactérias, num processo conhecido como transformação. Protocolos tradicionais para a preparação de células electrocompetentes são demorados e trabalhosos. Este artigo descreve uma alternativa, rápida e eficiente método para a preparação de células electrocompetentes atualmente empregadas por alguns laboratórios.

Protocolo Rápido para Preparação de electrocompetentes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; E<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

rapid-protocol-for-preparation-electrocompetent-escherichia-coli

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

76.2K visualizações.  University of Texas Brownsville.  A electroporação é um método vulgarmente utilizado para a introdução de ADN em bactérias, num processo conhecido como transformação. Protocolos tradicionais para a preparação de células electrocompetentes são demorados e trabalhosos. Este artigo descreve uma alternativa, rápida e eficiente método para a preparação de células electrocompetentes atualmente empregadas por alguns laboratórios. 

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Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

Vibrio cholerae: organismo modelo para estudar Patogênese Bacteriana - Entrevista

Biologia

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Um ensaio para medir a atividade do Escherichia coli Induzível Lisina Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

High Throughput Screening da atividade endoglucanase de fungos em Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Usando sintéticos matrizes genéticas

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Protocolos para implementação de uma<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Com base TX-TL Expression System-Free Cell para Biologia Sintética

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Detecção de Vivo<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 Células por PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

A purificação cromatográfica do não-polipéptidos recombinantes Elastina semelhantes e suas fusões com Peptídeos e Proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

As multifacetadas benefícios da proteína Co-expressão em<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...