Somente e somente proteínas de ligação controlam múltiplos processos biológicos. Este método FLAG-Biotin CLIP-seq, portanto, para traçar o perfil global do arranjo especial e temporal de RNAs e RBPs em células de mamíferos. Este método permite a detecção eficiente de RNAs diretas ligadas à proteína sem SDS-PAGE e os procedimentos de transferência de membrana.
Comparado com o CLIP-seq tradicional é isótopo livre e não requer anticorpo específico de proteína. Comece emplacando cerca de 3 milhões de células STEM embrionárias de camundongos em uma placa de 10 centímetros e incubando-as durante a noite. No dia seguinte, remova o meio com um vácuo e trate as células com dois mililitros de 0,25% de trippsina EDTA por dois minutos em temperatura ambiente.
Sacie a trippsina com quatro mililitros de meio MESC fresco, e transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Em seguida, centrifuá-los a 300 vezes G por três minutos a quatro graus Celsius e remover o supernante. Suspenda as células em quatro mililitros de PBS frios e transfira-as de volta para a placa de 10 centímetros para ligação cruzada.
Irradie as células com uma luz UV de 254 nanômetros, em seguida, transfira as células transversais para um tubo de 15 mililitros. Gire essas células a 300 vezes G por três minutos a quatro graus Celsius, depois remova o sobrenasci e lise as células com 500 microliters de Buffer A preparados de acordo com as instruções do manuscrito. Transfira as células para um tubo de 1,5 mililitro sem RNAse e incuba-as a quatro graus Celsius com rotação suave por 30 a 60 minutos.
Trate o lise com 30 microliters de DNAse 1 a 37 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, pare a reação adicionando quatro microliters de 0,5 molar EDTA. Gire a pelota insolúvel centrifugando a 12.000 vezes G por 20 minutos a quatro graus Celsius, e transfira o supernante para um novo tubo pré-refrigerado de 1,5 mililitro.
Transfira a célula para contas flag pré-equilibradas e incubar a amostra a quatro graus Celsius enquanto gira por duas a quatro horas. Após a incubação, centrifufique as contas por dois minutos a 3000 vezes G e remova o supernaspe. Adicione 500 microliters de Buffer A à amostra, e incubado a 4 graus Celsius por cinco minutos, em seguida, gire as contas e remova o supernante.
Repita a lavagem com buffer A, seguido por duas lavagens com buffer pré-refrigerado B.To elute com um peptídeo X FLAG, prepare a solução de elução conforme descrito no manuscrito do texto e gire as contas de BANDEIRA. Remova o supernatante com uma ponta de pipeta final estreita e adicione 200 microliters da solução de elução X FLAG para cada amostra. Incubar as amostras por 30 minutos a quatro graus Celsius com rotação suave.
Em seguida, gire as contas por dois minutos a 3000 vezes G.Transfira o supernato para um tubo fresco e repita a elução duas vezes. Economize 5% dos eluentes para análise de manchas ocidentais ou coloração de prata para verificar a eficiência da imunoprecipitação flag. Transfira os eluentes puxados para contas de streptavidin preparadas e gire as amostras suavemente a quatro graus Celsius por uma a três horas ou durante a noite.
Em seguida, colete as contas em um suporte magnético e remova o supernatante. Lave as contas duas vezes com 500 microliters de Buffer C com rotação suave por cinco minutos por lavagem. Em seguida, lave as contas duas vezes com 500 microliters de Buffer D, e duas vezes com 500 microliters de tampão PNK gelado, coletando as contas no suporte magnético e removendo o sobrenadante entre as lavagens.
Para realizar a digestão parcial do RNA, adicione 100 microliters de solução MNA a cada amostra e vórtice fixado a 37 graus Celsius com um mixer térmico por 10 minutos. Colete as contas com um suporte magnético por 30 segundos e remova o supernatante. Em seguida, lave-os com tampão PNK-EDTA, Buffer C e PNK buffer de acordo com as instruções do manuscrito.
Colete as contas com o suporte magnético e remova o tampão. Em seguida, adicione a mistura de reação CIP e o vórtice das contas a 37 graus Celsius com uma batedeira térmica por 10 minutos. Lave rapidamente as contas duas vezes com 500 microliters de tampão PNK EDTA gelado, seguido por duas lavagens com 500 microliters de tampão PNK gelado.
Após as lavagens, adicione 40 microliters de três misturas de ligadura de ligação prime às contas, e vórtice-os a 16 graus Celsius com uma batedeira térmica por três horas ou durante a noite. A ligadura eficiente do linker aos aliados é fundamental para este experimento. Verifique o tubo de reação ocasionalmente para ter certeza de que estes não precipitam durante a ligadura.
Após a incubação, repita as lavagens com tampões PNK EDTA e PNK, adicione 40 microliters de PNK misturados às contas e o vórtice deles a 37 graus Celsius com a batedeira térmica por 10 minutos. Lave as contas com buffers PNK EDTA e PNK, em seguida, proceda com o isolamento do RNA, conforme descrito no manuscrito do texto. Em comparação com a purificação mediada por BANDEIRA ou streptavidin mediada por um passo, a purificação de tandem FLAG-Biotin removeu quase todas as proteínas purificadas do núcleo, evitando a contaminação de interações indiretas de RNA proteica.
LIN28 e WDR43, Fbio CLIP-seq foi realizado usando células STEM embrionárias do rato. No total, cerca de 7,7 milhões e 2,2 milhões de leituras exclusivas foram recuperadas para LIN28 e WDR43, respectivamente. A comparação das visualizações da faixa mostra diferentes padrões de ligação no lócus pré-rRNA RN45.
Os sites intercedentais no motivo GGA G de pré-let7-g RNA por LIN28, Fbio CLIP-seq ou identificados. Além disso, foram determinados motivos enriquecidos de RNA nos locais de ligação e a porcentagem de nucleotídeos mutantes em diferentes tipos de mutações. Mostrando que lin28 prefere se ligar ao nucleotídeo genético.
Bem, às 22:00, este protocolo, é importante confirmar a eficiência da imunoprecipitação para garantir que os complexos da proteína fossem purificados com sucesso.
