Este protocolo descreve como as larvas transgênicas de zebrafish podem ser usadas para fornecer um ensaio quantitativo in vivo da vascularização do xenoenxerto tumoral. A principal vantagem dessa técnica em relação às técnicas anteriores é que permite ao pesquisador quantificar com precisão as mudanças nos níveis de vascularização do xenoenxerto. O passo fundamental é garantir que as células tumorais sejam injetadas corretamente em larvas de zebrafish para que as etapas subsequentes de imagem e quantitação não sejam comprometidas.
Depois de crescer e rotular células B16-F1 com corante fluorescente, comece a preparar embriões para implantação. Encha um prato de 35 milímetros com uma solução de 2%de metilcelulose na solução E3 para um quarto do volume do prato. Utilizando uma pipeta de transferência, coloque aproximadamente 50 embriões transgênicos previamente preparados na metilcelulose, minimizando o volume da solução E3 transferida.
Usando uma ponta de pipeta microcapillary, organize os embriões para que todos sejam orientados verticalmente com a cabeça até o topo, caudas até o fundo, e o embrião com o lado esquerdo para cima. Adicione 50% de ECM a uma pelota de célula B16-F1 previamente preparada para produzir uma mistura de células para ECM em uma proporção de dois para um. Misture bem por pipetar e mexer, e armazene a mistura no gelo.
Use uma pipeta microcapilar para ocupar de 3 a 10 microlitres de células. Insira cuidadosamente a ponta da pipeta em uma agulha de microinjeção previamente preparada e, em seguida, ejete a mistura da matriz B16-F1 na extremidade da agulha. Insira a agulha no suporte da agulha e incline em um ângulo de 45 graus para o prato.
Use pinças para quebrar a ponta da agulha para fazer um buraco grande o suficiente para que as células sejam ejetadas da agulha sem apertar as células. Ligue o cilindro de ar pressurizado ligado ao aparelho de injeção e, em seguida, gire momentaneamente o injetor no modo contínuo por não mais de um segundo para empurrar as células para a ponta da agulha. Aponte a agulha em direção ao saco de gema de um embrião, e empurre-a através do saco de gema em uma direção ventral até que a ponta da agulha tenha emergido do saco de gema e esteja empurrando a epiderme embrionária no lado ventral do embrião, apenas posterior ao coração.
Empurre cuidadosamente e ligeiramente a ponta da agulha para a frente até que ela tenha criado um pequeno espaço entre a epiderme e a membrana do saco de gema. Pulso o injetor para ejetar um pouco da mistura celular neste espaço perivitelline. Olhe cuidadosamente para o tamanho, forma e localização do xenoenxerto como ele está sendo implantado, e ajuste o número de pulso e a posição da agulha de acordo para garantir um xenoenxerto corretamente implantado.
Repita os pulsos até que 500 a 800 células tenham sido injetadas no espaço perivitelline, criando uma protuberância visível que se estende pelo menos metade do caminho ao longo da parte inferior do saco de gema. Remova a agulha do embrião. Depois de injetar todos os embriões, use uma ponta de pipeta microcapilar para empurrar todos os embriões juntos para que eles possam ser escoados com o mínimo de metilcelulose possível.
Transfira os embriões para um prato de recuperação contendo E3 com PTU e azul metileno. Em seguida, gentilmente pipeta E3 em torno dos embriões para lavá-los, e, em seguida, incubar a 34 graus Celsius. Em seguida, imagem anesthetizado embriões usando um microscópio confocal.
Use um canal laser apropriado para as células tumorais para determinar um volume a ser imageado, permitindo pelo menos uma ou duas seções ópticas de cada lado do enxerto. Use intervalos de seção com cerca de cinco micrômetros de distância para criar uma pilha Z. Use imagens de dois canais para fotografar os vasos sanguíneos e o xenoenxerto tumoral.
Imagem do xenoenxerto tumoral e vasos sanguíneos para uma larva, e repita esses passos para que cada larva seja imagen. Para começar com a quantitação da resposta angiogênica ao xenoenxerto de zebrafish, transfira arquivos de imagem confocal de pilha Z previamente criados de um xenoenxerto tumoral para uma nova pasta no software de análise de imagem 3D. Para criar o protocolo Volume de Tumor para medir o volume de xenenerto tumoral, vá para a guia Medição no menu superior da janela e, em seguida, da lista de protocolos que aparece arraste o protocolo chamado Find Objects para o espaço que é intitulado Drag Tasks Here To Make Measurements.
Depois de garantir que este protocolo seja definido para medir objetos no canal do tumor, arraste os protocolos chamados Clip To ROIs e Make ROI From Population da lista de protocolos para o espaço Drag Tasks Here To Make Measurements, certificando-se de que esses dois comandos se apliquem aos objetos identificados pelo Find Objects. Antes de calibrar as configurações deste protocolo, vá para o menu suspenso acima da etiqueta Mode no canto superior esquerdo da janela e selecione a exibição Extended Focus. Desmarque os canais não tumorais no painel à direita clicando no círculo preto sob cada direção do canal para que apenas o canal tumore pode ser visto.
Em seguida, use a ferramenta Freehand na parte superior da janela para desenhar uma região de interesse, ou ROI, em torno de todo o volume do tumor. No painel abaixo da imagem, selecione o rótulo Resumo e, em seguida, defina a opção Exibir para mostrar a população dois. Para calibrar, na tarefa Encontrar objetos, clique no asterisco para abrir a janela de configurações.
Ajuste o limiar usando intensidade e determine o limiar inferior até que apenas as células tumorais sejam selecionadas e não a fluorescência de fundo. Determine o tamanho mínimo do objeto para que apenas células intactas sejam medidas, em oposição a itens menores de detritos celulares, definindo o tamanho mínimo do objeto como 100 micrômetros cúbicos. Salve este protocolo como Volume de Tumor clicando na guia Medidas no menu superior e clicando em Salvar Protocolo.
Use as mesmas configurações para medir todos os xenoenxertos. Para medir o volume dos vasos sanguíneos associados ao xenoenxerto, crie um novo protocolo indo para o menu superior e, em seguida, clicando na guia Medidas e, em seguida, Protocolo Claro. Arraste as tarefas Find Objects e Clip To ROIs para o espaço intitulado Arrastar tarefas aqui para fazer medições para este protocolo.
Certifique-se de que o primeiro comando está definido para medir objetos no canal do vaso sanguíneo e que o seguinte comando está definido para aplicar aos objetos identificados pelo primeiro comando. Em seguida, desmarque os canais não-vasos no painel de extrema-direita para que apenas os vasos sanguíneos possam ser vistos. Determine as configurações do protocolo de volume de vasos de forma semelhante ao protocolo de volume de tumor descrito anteriormente e salve este protocolo como Volume de Vasos.
Limpe o protocolo e desenhe um ROI em torno do xenoenxerto, tomando cuidado para não incluir nenhuma autofluorescência não tumoral. Para medir a soma do volume dos objetos no canal do tumor dentro deste ROI, clique na guia Medidas, selecione o comando Protocolo de Restauração, escolha o protocolo volume do tumor e clique em Restaurar. Usando o novo ROI feito pelo protocolo Volume do Tumor, clique na guia Medidas e selecione o comando Protocolo de Restauração, escolha o protocolo de volume de vasos e clique na linha de soma para calcular o volume total de objetos no canal da embarcação dentro deste ROI.
Divida o volume do vaso pelo volume do tumor e multiplique a resposta por 100 para obter um valor percentual de vascularização do enxerto. Ao fotografar um xenoenxerto individual aos seis, 24 e 48 horas após a implantação, a resposta angiogênica em diferentes pontos de tempo pode ser calculada, com a maior resposta angiogênica entre 24 a 48 horas após a implantação e os níveis máximos de vascularização do enxerto vistos em torno de 48 horas. Imagens de lapso de tempo confocal de um xenoenxerto B16-F1 implantado em um embrião de zebrafish pós-fertilização pós-fertilização mostra vasos sanguíneos rotulados por GFP crescendo através do xenoenxerto, formando uma rede de torção com vasos de tamanho irregular e morfologia típicos da rede vascular anormal vista em tumores mamíferos.
Os xenoenxertos incubados no inibidor VEGFR mostram grande redução de vasos em comparação com os xenoenxertos de controle incubados no DMSO. Em embriões de controle, houve uma rede vascular expansiva que se estende por toda a região do xenoenxerto, a resposta angiogênica típica observada após a implantação de células B16-F1. Quando quantificada, a resposta angiogênica mostra uma clara redução na vascularização do enxerto nos xenoenxertos tratados pelo inibidor VEGFR quando comparados aos controles.
O canal do tumor mostra uma massa de células B16-F1 rotuladas fluorescentemente abaixo do saco de gema, que exibe autofluorescência. Portanto, um ROI deve ser cuidadosamente desenhado em torno do xenoenxerto, tomando cuidado para não incluir qualquer uma das autofluorescência do saco de gema. O protocolo de volume tumor identificou todas as células B16-F1 no ROI, mediu seu volume e cortou o ROI em seu volume.
O Protocolo de Volume de Vasos tumorais neste novo ROI cortado permitiu a identificação de todos os vasos associados à massa de células B16-F1 e mediu seu volume. Os valores dos protocolos de volume de tumor e volume de vasos tumorais podem ser usados para dar uma medida de vascularização do enxerto. A trato e a permeabilidade genética dos zebrafish permitem a investigação de altas vias de sinalização na angiogênese tumoral, e também pode atuar como uma plataforma de triagem para identificar compostos anti-angiogênicos.
