Podemos isolar e montar probióticos que podem tanto promover a saúde dos corais quanto, ao mesmo tempo, mitigar o impacto da poluição e que podem contribuir para a persistência de um recife no mundo em mudança. A abordagem de isolamento e triagem descrita pode ser usada para selecionar microrganismos que apresentem atividades metabólicas fundamentais, como a degradação de poluentes ou outras características benéficas para organismos marinhos, como corais. Este método pode ser aplicado para isolar microrganismos capazes de degradar quaisquer contaminantes.
Além disso, outras fontes de material podem ser utilizadas em outras amostras ambientais, como plantas, solo, água, qualquer coisa. Estude a literatura e tente focar em cepas que podem ser boas candidatas para o seu propósito. Se possível, direcione os métodos de isolamento para essas cepas e evite patógenos conhecidos.
E se você pretende usar um consórcio de bactérias, também é muito importante primeiro investigar se os membros do consórcio têm atividade antagônica uns contra os outros. Como os corais estão sob risco crescente de extinção, essa metodologia está começando a ser iniciada em todo o mundo e há a necessidade de disseminar e padronizar o método. Como alguns pesquisadores de corais não têm experiência com microbiologia convencional, é por isso que eles têm pedido frequentemente conselhos sobre como proceder com essa abordagem.
Para começar, a partir de cada local de amostragem direcionado, use garrafas estéreis com tampas de parafuso para coletar 500 mililitros de água em triplicado. Se o processamento da amostra estiver acontecendo mais tarde, mantenha as garrafas a quatro graus Celsius. Use um par estéril de alicate e fórceps para cortar fragmentos de coral do mesmo local de amostragem das amostras de água.
Enxágüe o fragmento de coral amostral usando 20 mililitros de solução salina estéril de 3% ou água do mar artificial para se livrar das bactérias livre-vivas da água do mar. Com fórceps, coloque cada fragmento de coral em um recipiente estéril com uma tampa de parafuso contendo solução salina estéril. Usando fórceps e alicates estéreis, pesam cinco gramas de fragmentos de coral em placas estéreis de Petri em uma balança de pesagem.
Transfira os cinco gramas de amostra de coral para uma argamassa estéril e macerá-la usando um pilão estéril. Usando uma espátula estéril, transfira a amostra macerada para um frasco de cultura estéril contendo 25 mililitros de solução estéril de cloreto de sódio de 3% e 10 a 15 contas de vidro de 2,5 milímetros. Use 20 mililitros de solução salina estéril para lavar a argamassa no tubo para recuperar a quantidade máxima do macerado.
Para separar microrganismos de diferentes compartimentos de corais, mantenha os frascos sob constante agitação em 150 vezes g durante 16 horas na temperatura da água do local de amostragem. Para selecionar bactérias, primeiro realize diluições seriais até 10 a nove negativos em solução salina estéril para amostras de corais e até 10 a seis negativos para amostras de água. A pipeta dilui para cima e para baixo cinco vezes antes de descartar a ponta.
Então vórtice cada um. Vórtice as amostras por cinco segundos cada vez antes de realizar a próxima diluição serial. Pipeta 100 microliters de cada diluição em placas de Petri contendo 3% de cloreto de sódio lysogeny caldo médio e emplacê-los.
Incubar as placas por um a três dias na temperatura alvo, por exemplo, 26 graus Celsius. Verifique as placas uma vez por dia. Selecione e isole as colônias apresentando morfologias de crescimento distintas em novas placas usando a técnica da placa de raia.
Repita este passo quantas vezes necessário para ter colônias puras crescendo nas placas. Armazene os isolados a quatro graus Celsius ou em glicerol, conforme descrito no manuscrito. Para realizar o teste de capacidade de degradação EE2, escolha uma única colônia das placas frescas e inoculada em dois mililitros de meio LB estéril em um tubo.
No caso de ser um estoque de glicerol, pegue 10 microliters de estoque bacteriano glicerol e listrado em placas de ágar LB. Incubar a 24 a 28 graus Celsius durante a noite para ter colônias únicas crescendo. Coloque o tubo contendo lb médio inclinado sob agitação constante a 150 vezes g a 24 a 28 graus Celsius durante a noite.
Após o crescimento bacteriano, pelota as células centrifugando-as a 8.000 vezes g por oito minutos em temperatura ambiente. Descarte o supernaspeso. Para lavar o caldo LB restante, adicione dois mililitros de água salina para resuspensar as células.
Repita a lavagem duas vezes para garantir que não haja vestígios de fonte de carbono. Inocular as células lavadas e resuspended em meio mínimo de cultura Bushnell Haas contendo EE2 como a única fonte de carbono. Avalie o crescimento bacteriano por densidade óptica em 600 nanômetros e nossa colônia formando unidades no meio ágar LB após 16 a 72 horas de incubação.
Para preparar uma mídia mínima contendo uma fração solúvel em água de óleo e uma fração insolúvel de óleo-água como a única fonte de carbono, adicione 1-2% de petróleo bruto a 500 mililitros de água destilada estéril em um frasco de filtro contendo uma válvula na parte inferior. Mantenha o frasco sob agitação constante a 24 a 28 graus Celsius a 150 vezes g durante 48 horas. Depois disso, coloque o frasco em uma superfície estável e espere de 10 a 20 minutos para permitir que a fração solúvel e insolúvel separe.
Em seguida, abra o frasco do filtro inferior para transferir a fração solúvel de água de óleo para um novo frasco estéril salvando a fração insolúvel óleo-água. Então prepare duas garrafas de Bushnell Haas agar mínimo médio. Autoclave-o.
Combine com a fração solúvel em água de óleo como a única fonte de carbono a fazer 500 mililitros de ágar médio. Faça o mesmo com a fração insolúvel de água de óleo e transfira aproximadamente 25 mililitros de cada meio para placas individuais de Petri. Para isolar bactérias degradantes do óleo, reutilize amostras previamente diluídas e pipetas 100 microliters de cada diluição nas placas de Petri contendo meio de ágar e emplaque-as.
Lembre-se de manter controles negativos para suas placas. Incubar os pratos por um a três dias na temperatura alvo e repetir os procedimentos de isolamento como anteriormente. Neste protocolo, os microrganismos foram isolados de diferentes fontes de água e nubbins de coral apresentando características putativas do BMC e capazes de degradar diferentes classes de contaminantes.
Utilizando amostras de água coletadas em uma estação de tratamento de esgoto obtidas no Centro Experimental de Saneamento Ambiental da Universidade Federal do Rio de Janeiro, foram isoladas 33 cepas bacterianas capazes de degradar o EE2. Além disso, utilizando-se a técnica para a seleção de bactérias degradantes do óleo, 20 cepas capazes de degradar tanto a fração solúvel em óleo quanto a fração insolúvel em água de óleo foram isoladas. Características putativas do BMC foram rastreadas em microrganismos, entre elas uma cepa que apresentava forte atividade antagônica contra o patógeno de coral Vibrio cholerae lyticus, cepas capazes de degradar a ureia, um bom produtor de catalase, e microrganismos apresentando genes potencialmente benéficos foram encontrados.
Empregando tanto a bioremediação quanto a inoculação do BMC, foi possível prever corais devido aos impactos da exposição ao óleo. Um consórcio de bioremediadores de petróleo da PBMC isolado do coral foi inoculado em nubbins de corais expostos a 1% de óleo. Mostrou uma melhor capacidade fotoquímica preservada em comparação com a saúde dos corais sem inoculação.
Não deixe amostras em temperatura ambiente por muito tempo. Caso contrário, a comunidade microbiana pode mudar e micróbios relacionados a doenças podem superar outros. O petróleo bruto é tóxico.
Certifique-se de usar equipamentos de proteção individual apropriados ao trabalhar com este ou qualquer outro contaminante que você decida usar. A técnica pavimentou uma forma inovadora no campo da restauração de corais e a bioremediação oceânica pode potencialmente ser usada para minimizar os impactos econômicos, ecológicos e sociais causados pela mudança global.
