Мы можем изолировать и собирать пробиотики, которые могут способствовать здоровью кораллов и в то же время смягчать воздействие загрязнения, и это может способствовать сохранению рифа в меняющемся мире. Описанный подход к изоляции и скринингу может использоваться для отбора микроорганизмов, отбирающих ключевые метаболические виды деятельности, такие, как деградация загрязняющих веществ или другие полезные характеристики для морских организмов, таких, как кораллы. Этот метод может быть применен для изоляции микроорганизмов, способных деградировать любые загрязняющие вещества.
Кроме того, другие источники материала могут быть использованы в других экологических образцах, таких как растения, почва, вода, что угодно. Изучите литературу и попытаться сосредоточиться на штаммов, которые могут быть хорошими кандидатами для вашей цели. Если это возможно, направить методы изоляции для этих штаммов и избежать известных патогенов.
И если вы стремитесь использовать консорциум бактерий, это также очень важно, чтобы сначала исследовать, если члены консорциума имеют антагонистической деятельности друг против друга. Поскольку кораллы находятся под возрастающей опасностью исчезновения, эта методология начинает начинаться во всем мире, и есть необходимость распространения и стандартизации метода. Поскольку некоторые исследователи кораллов не имеют опыта работы с традиционной микробиологией, именно поэтому они часто просят совета о том, как действовать с таким подходом.
Для начала, с каждого целевого участка отбора проб, используйте стерильные бутылки с винтовыми колпачками, чтобы собрать 500 миллилитров воды в трипликате. Если обработка образцов происходит позже, держите бутылки на уровне четырех градусов по Цельсию. Используйте стерильную пару плоскогубцев и типсов, чтобы вырезать коралловые фрагменты из одного и того же места отбора проб воды.
Промыть образец коралловых фрагментов с помощью 20 миллилитров стерильного 3%солевого раствора или искусственной морской воды, чтобы избавиться от слабо прикрепленных свободно живых бактерий морской воды. Используя типсы, поместите каждый коралловый фрагмент в стерильный контейнер с винтовой крышкой, содержащей стерильный солевой раствор. Используя стерильные типсы и плоскогубцы, взвешивайте пять граммов коралловых фрагментов в стерильных чашках Петри на взвешивании.
Перенесите пять граммов кораллового образца в стерильный раствор и вынудить его с помощью стерильного пестика. Используя стерильный шпатель, перенесите мацерированный образец в стерильную культурную колбу, содержащую 25 миллилитров стерильного раствора хлорида натрия и от 10 до 15 стеклянных бусин по 2,5 миллиметра. Используйте 20 миллилитров стерильный солевой раствор для мытья раствора в трубку, чтобы восстановить максимальное количество мацерат.
Чтобы отделить микроорганизмы от различных коралловых отсеков, держите колбы под постоянным возбуждением в 150 раз г в течение 16 часов при температуре воды места отбора проб. Для выбора бактерий сначала выполняются серийные разбавления до 10-отрицательных девяти в стерильном солевом растворе для образцов кораллов и до 10 до отрицательных шести для образцов воды. Пипетка разбавляет вверх и вниз пять раз, прежде чем отказаться от кончика.
Затем вихрь каждый из них. Vortex образцы в течение пяти секунд каждый раз перед выполнением следующего серийного разбавления. Pipette 100 микролитров каждого разбавления на чашках Петри, содержащих 3% хлорида натрия лизогенный бульон агар среды и пластины их.
Инкубировать пластины в течение одного-трех дней при целевой температуре, например 26 градусов по Цельсию. Проверяйте тарелки один раз в день. Выберите и изолируйте колонии, представляя различные морфологии роста на новых пластинах, используя технику полосы пластины.
Повторите этот шаг столько раз, сколько необходимо, чтобы иметь чистые колонии, растущие на тарелках. Храните изоляты при четырех градусах цельсия или в глицероле, как описано в рукописи. Для выполнения теста на способность к деградации EE2 выберите одну колонию из свежих пластин и прививки в двух миллилитров стерильной среды LB в трубке.
В случае, если это глицерол запас, принять 10 микролитров глицерол бактериального запаса и полоса на пластины LB агара. Инкубировать при 24 до 28 градусов по Цельсию в одночасье, чтобы иметь одиночные колонии растет. Поместите трубку, содержащую LB среды склонен под постоянным возбуждением в 150 раз g при 24 до 28 градусов по Цельсию в одночасье.
После роста бактерий, гранулы клеток центрифугирования их на 8000 раз г в течение восьми минут при комнатной температуре. Откажитесь от супернатанта. Чтобы вымыть оставшийся бульон LB, добавьте два миллилитров солевой воды, чтобы повторно использовать клетки.
Повторите стирку дважды, чтобы гарантировать, что нет никаких следов источника углерода. Прививать промытые и перерасходные клетки в минимальной среде культуры Бушнелл Хаас, содержащей EE2 в качестве единственного источника углерода. Оцените рост бактерий по оптической плотности на 600 нанометров и нашей колонии формирования единиц на LB агар среды после 16 до 72 часов инкубации.
Для подготовки минимальных средств массовой информации, содержащих растворимую в масле фракцию и нерастворимую фракцию в качестве единственного источника углерода, добавьте 1-2% сырой нефти в 500 миллилитров стерильной дистиллированной воды в фильтровальную колбу, содержащую клапан на дне. Держите колбу под постоянным возбуждением при 24-28 градусах Цельсия при 150 раз г в течение 48 часов. После этого поместите колбу на стабильную поверхность и подождите 10-20 минут, чтобы растворимая и нерастворимая фракция отделилась.
Затем откройте нижнюю фильтровальную колбу для переноса растворимой в масле фракции в новую стерильную колбу, экономя жирорастворимую фракцию. Затем приготовьте две бутылки Бушнелл Хаас агар минимальной среде. Автоклав.
Комбинат с масляной водорастворимой фракции в качестве единственного источника углерода, чтобы сделать 500 миллилитров агар среды. Сделай то же самое с нерастворимой фракцией с масляной водой и перенесите примерно 25 миллилитров каждой среды на отдельные блюда Петри. Чтобы изолировать масляные бактерии, повторно ими использовать ранее разбавленные образцы и пипетки 100 микролитров каждого разбавления на чашки Петри, содержащие агар средних и пластины их.
Не забудьте сохранить отрицательный контроль для ваших пластин. Инкубировать посуду в течение одного-трех дней при целевой температуре и повторить процедуры изоляции, как и раньше. В этом протоколе микроорганизмы были изолированы от различных источников воды и коралловых нуббинов, представляя сшатующие характеристики BMC и способные деградировать различные классы загрязняющих веществ.
Используя пробы воды, собранные на очистных сооружениях, полученные в Экспериментальном центре санитарии окружающей среды Федерального университета Рио-де- Кроме того, используя метод отбора масляных бактерий, 20 штаммов, способных деградировать как масляно-водорастворимая фракция, так и нерастворимая фракция масляной воды, были изолированы. У микроорганизмов были проверены лечебные характеристики BMC, среди которых штамм, представляя сильную антагонистическую активность против кораллового патогена Vibrio cholerae lyticus, штаммы, способные деградировать мочевину, хороший производитель каталазы, и микроорганизмы, присутствующие потенциально полезные гены, были найдены.
Используя как биовосстановление, так и прививку от BMC, можно было предсказать кораллы в результате воздействия воздействия нефти. Нефтяной биоремедиатор PBMC консорциум изолирован от кораллов был привит на коралловых нуббинов подвергаются 1%нефти. Он показал лучше сохранившуюся фотохимическую способность по сравнению со здоровьем кораллов без прививки.
Не оставляйте образцы при комнатной температуре слишком долго. В противном случае микробное сообщество может измениться, и микробы, связанные с болезнями, могут разрастать других. Сырая нефть токсична.
Пожалуйста, убедитесь, что вы используете соответствующее средства индивидуальной защиты при работе с этим или любым другим загрязняющим веществом, которое вы решите использовать. Эта методика проложила новаторский путь в области восстановления кораллов и восстановления океана потенциально может быть использована для сведения к минимуму экономических, экологических и социальных последствий, вызванных глобальными изменениями.
