Uma interação letal sintética entre dois genes ocorre quando um único knockdown de qualquer um não afeta a viabilidade celular, mas o knockdown de ambos os parceiros letais sintéticos leva à perda de viabilidade celular ou morte celular. A combinação de conjuntos de dados heterogêneos pode levar à identificação de interações letais sintéticas que podem ser alvo de combinações de medicamentos em doenças como o câncer, com o objetivo de parar a proliferação celular. O conceito de letalidade sintética é de interesse para qualquer doença em que a proliferação celular seja um problema.
Quanto ao câncer, as interações genéticas letais sintéticas já estão sendo direcionadas em tumores mutados pelo BRCA usando inibidores PARP. Esforços como o nosso poderiam expandir o uso do conceito para outras interações genéticas e entidades oncológicos. Em nosso laboratório, testamos combinações computacionalmente previstas de drogas visando interações letais sintéticas no contexto do câncer de mama.
Comece recuperando dados do BioGRID. Use o navegador da Web para baixar o arquivo de interação BioGRID mais recente no formato tab2. Filtre as colunas para reter apenas as relevantes para etapas de análise subsequentes.
Em seguida, filtro para letalidade sintética e interações genéticas negativas. Use as informações na coluna Sistema Experimental para restringir o conjunto de dados a entradas com um valor de letalidade genética negativa ou sintética. Identificar as espécies para as quais foram relatadas interações letais sintéticas, determinando o número de IDs fiscais de parceiros de interação letal sintética, o que fornecerá uma estimativa sobre o número dessas interações disponíveis por organismo.
Para recuperar ortologs humanos para organismos modelos relevantes do Ensembl BioMart, selecione o respectivo conjunto de dados do organismo modelo, clique em Atributos e selecione o nome Gene. Em seguida, clique em Dataset e selecione genes humanos. Novamente, clique em Atributos e selecione o nome Gene.
Em seguida, clique em Resultados. Verifique apenas os resultados exclusivos e clique em Go.Automatize o processo de recuperação e envie a consulta diretamente ao acesso BioMart RESTful para recuperar os pares genéticos ortologos. Se recuperar os dados manualmente através da interface web Ensembl BioMart, renomeie e observe que a linha de cabeçalho foi adicionada automaticamente.
A fim de recuperar os genes humanos ortologos para outros organismos modelo, substitua o valor do atributo de nome do primeiro elemento de conjunto de dados com o nome do respectivo conjunto de dados Ensembl. Em seguida, descarte quaisquer entradas para genes sem homólogos, colete todos os mapeamentos homólogos em um único arquivo e adicione mapeamentos falsos para genes humanos. Além disso, adicione entradas artificiais para genes humanos.
Prepare o arquivo de synlet para a adesão subsequente adicionando para cada parceiro de interação uma nova coluna segurando a combinação de ID fiscal e símbolo genético. Junte-se a interações letais sintéticas baseadas na ID fiscal do organismo e no símbolo genético com os pares ortologos recuperados. Recuperar pares de alvos de drogas do DrugBank da seção Downloads, criando uma conta primeiro, se necessário.
Restringir o arquivo de alvo de drogas do DrugBank a colunas relevantes. Só reter entradas para entidades moleculares humanas. Em seguida, extrair as colunas relevantes e filtrar os dados para espécies humanas.
Uma vez que o nome da droga e as informações de alvo de drogas são fornecidas em dois arquivos CSV separados, as informações dos dois arquivos devem ser mescladas. Para isso, as entradas do nome da droga devem ser normalizadas primeiro. Em seguida, normalizar o arquivo alvo da droga para ter uma linha por droga.
Continue com o arquivo de vocabulário do DrugBank e extraia as colunas relevantes. Uma vez que o nome da droga e as informações de alvo de drogas são fornecidas em dois arquivos CSV separados, mescla as informações dos dois arquivos usando o DrugBank ID comum.Junte-se ao conjunto de dados de interação letal sintética com o arquivo de nome de droga alvo de drogas gerado na etapa anterior usando as colunas de símbolos genéticos, certificando-se de adicionar nomes de drogas para ambos os parceiros de cada interação letal sintética. Finalmente, recupere informações sobre ensaios clínicos de ClinicalTrials.gov.
Para fácil acesso, utilize o banco de dados relacional fornecido pela Clinical Trials Transformation Initiative, criando uma conta primeiro, se necessário. Dissolver os medicamentos propostos em solventes apropriados, como DMSO ou PBS, em pelo menos quatro concentrações diferentes. Adicione os medicamentos às células de câncer de mama humanas semeadas em uma placa de 96 poços, e incuba-as pelo tempo desejado para determinar os valores de concentração inibitória.
Use um ensaio de viabilidade ou apoptose de escolha para determinar a viabilidade celular com várias combinações e concentrações de medicamentos, começando com o IC50 previamente estabelecido. Em seguida, determine os efeitos citotóxicos sinérgicos das combinações de drogas calculando seu índice combinatório. Este método foi usado para identificar combinações de drogas visando interações letais sintéticas no câncer de ovário.
Verificou-se que 21 drogas únicas contribuíram para 84 combinações de drogas identificadas visando um conjunto de 39 interagidores letais sintéticos. O mesmo fluxo de trabalho foi utilizado para identificar 243 combinações promissoras de medicamentos visando 166 pares de genes letais sintéticos no contexto do câncer de mama. Combinações selecionadas foram testadas para seu impacto na viabilidade celular e apoptose em duas linhas de células cancerígenas de mama.
Os resultados do ensaio de viabilidade para celecoxib, ácido zoledrônico e a combinação de ácido zoledrônico e celecoxib nas linhas de células cancerígenas de mama SK-BR-3 demonstraram que, quando combinados, as drogas tinham um efeito sinérgico significativo na viabilidade celular. A coloração anexa em V e 7-AAD das células SK-BR-3 tratadas com as duas drogas por si só e combinadas mostrou que a porcentagem de células apoptóticas e necróticas tardias foi aumentada após o tratamento com a combinação da droga. Ao tentar este protocolo, tome o tempo necessário para identificar nomes de medicamentos correspondentes do DrugBank para todas as drogas e intervenções recuperadas de ensaios clínicos.
A inclusão de dados adicionais, como perfis de expressão genética ou o grau de anotação na literatura científica de interagidores letais sintéticos para a doença em estudo, pode ser usada ainda mais para priorizar interações letais sintéticas. Devido à crescente quantidade de dados biomédicos disponíveis, unir forças com biólogos computacionais é uma interação benéfica que leva a novas hipóteses a serem testadas em laboratório. Ao trabalhar com agentes citostáticos, certifique-se de seguir suas diretrizes locais que lidam com equipamentos de segurança de laboratório e o manuseio de reagentes perigosos.
A qualquer momento, evite contato direto e certifique-se de coletar informações sobre a substância usada antes de iniciar o experimento.
