Este método pode ser facilmente adaptado para observar sinais de outras proteínas fluorescentes ou pode ser usado para imagem de axônios em outros adultos A principal vantagem desta técnica facilita uma excelente reconstrução tridimensional e visualização dos axônios e suas arboris terminais. Comece preenchendo o número adequado de poços em uma placa de vidro multi-poço com 70% de etanol. Use um pincel para adicionar de 15 a 20 moscas anestesizadas de dióxido de carbono de qualquer idade ou sexo a cada poço e gentilmente dab as moscas no etanol até que elas estejam totalmente submersas.
Depois de não mais do que um minuto, enxágue as moscas três vezes com solução de detergente surfactante não-iônico de 0,3% em soro fisiológico tamponado por pelo menos 10 minutos por lavagem. Após a última lavagem, use fórceps para remover a cabeça e o abdômen de cada mosca sem danificar o segmento torácico ou as pernas e use a ponta de um par de fórceps finos para aplicar suavemente, mas firmemente, pressão na junção coxa-tórax para separar uma perna do segmento torácico. Coloque as pernas em um poço de uma nova placa multi-poço contendo 4% de paraformaldeído no gelo para uma incubação durante a noite a quatro graus Celsius.
É importante empurrar as pernas suavemente para dentro do tampão de fixação sem deixá-las flutuar para obter pernas bem fixas. No dia seguinte, lave as pernas cinco vezes em uma solução fresca de detergente surfactante não iônico de 0,3% por 20 minutos por lavagem. Após a última lavagem, substitua o detergente pelo meio de montagem e mantenha as pernas no meio de montagem por pelo menos 24 horas.
No dia seguinte, adicione aproximadamente 20 microlitros de 70% glicerol ao lado da extremidade revestida do slide do microscópio de vidro e cubra o glicerol com um deslizamento de tampa de 22 por 22 milímetros. Em seguida, adicione cerca de 10 microliter linha de montagem média à direita do deslizamento de tampas e aplique uma segunda linha de 30 microliter de médio de montagem à direita da linha de 10 microliter. Usando fórceps finos, transfira uma perna da placa multi-poço em uma gota de média para a faixa de 10 microliter de meio de montagem em uma orientação externa para cima ou para baixo.
Repita até que seis a oito pernas tenham sido montadas e alinhadas e coloque uma segunda mancha sobre as pernas de tal forma que o segundo deslizamento de cobertura repouse ligeiramente na primeira mancha de cobertura. Em seguida, use esmalte em cada canto das tampas para fixá-los no lugar. Para imaginar as pernas, use o laser de 488 nanômetros e dois detectores simultaneamente para configurar a primeira faixa para obter a fluorescência automática de GFP e cutícula.
Selecione um objetivo de imersão de óleo de 20 a 25X e defina a resolução para 1024 por 1024 pixels com uma profundidade de 12 bits e defina o espaçamento z para um micrômetro. Carregue o slide no estágio do microscópio e usando a mesma potência laser para ambos os detectores, ajuste o ganho do primeiro detector para obter um sinal GFP brilhante e ajuste o segundo detector para garantir que algumas áreas com um sinal de cutícula alta produzam um sinal saturado neste detector. Em seguida, imagem as pernas usando as opções de azulejo ou posição para capturar toda a perna se uma perna for estendida ou muito grande para ser visualizada em um único quadro.
Para processamento de imagem, abra a pilha confocal no ImageJ Fiji e use o plugin Bio-Formats para abrir quaisquer imagens que não estejam no formato TIFF. Para dividir os canais, selecione Imagem, Cor e Canais Divididos. Para subtrair o sinal de cutícula do sinal GFP, abra a Calculadora de Processo e Imagem e selecione a pilha do detector um como imagem um.
Na janela de operação, selecione subtrair e selecione a faixa do detector dois como imagem dois para que apenas o sinal edógeno de GFP seja obtido. Use Imagem, Pilhas, Z Proteger para gerar projeção de intensidade máxima para o sinal GFP endógeno. Use os controles na janela de controle de brilho para ajustar o brilho e o contraste.
Em seguida, gere uma intensidade média para a cutícula, seguida pelos canais de imagem, cor e mesclagem para mesclar a pilha GFP de volta com a pilha somente de cutícula adquirida do detector dois. Isso resultará em uma imagem RGB composta pelo sinal GFP específico do tecido, bem como no sinal de cutícula para ajudar a identificar as arbóreas de axônio dentro dos segmentos da perna. Para usar a macro, abra a pilha confocal e clique em Imagem, Ajuste e Brilho/Contraste.
Em seguida, clique em Plugin e Macro Run para executar a macro e siga as instruções. Quando solicitado a especificar a operação na janela calculadora de imagens, selecione a imagem um como pilha um. Na janela de operação, selecione subtrair.
Selecione a imagem dois como pilha dois. Quando solicitado a ajustar o contraste, use os controles na janela de controle de brilho para ajustar o contraste de brilho da imagem máxima de projeção do GFP e da projeção média da cutícula para gerar uma imagem fundida RGB de ambos os sinais mostrando o GFP em verde e a cutícula em cinza. Em seguida, mescle os resultados da pilha um e empilhe dois para gerar um GFP combinado e pilha de cutícula que pode ser usado na próxima etapa.
Para visualizar as pernas em três dimensões, abra a pilha RGB em um programa de software 3D apropriado. Na janela de diálogo pop-up, selecione todos os canais na seção de conversão de modo e digite o tamanho de um voxel obtido a partir da análise anterior. No módulo do canal um, clique com o botão direito do mouse e selecione Display e Volren.
Em seguida, clique à esquerda no módulo Volren. Na seção Propriedades, clique à esquerda em Avançado e selecione DDR. Em seguida, ajuste o valor gama para ver o fundo da cutícula.
No módulo do canal dois, clique com o botão direito do mouse e selecione Display Volren. Em seguida, clique no módulo Volren, edite e selecione volrenGreen.col. Por meio deste procedimento, o sinal da cutícula pode ser combinado com o sinal GFP para identificar o posicionamento dos axônios dentro das pernas.
É extremamente importante obter pernas bem fixas. Em pernas devidamente fixas, as estruturas internas dentro das pernas são de uma cor uniforme e as traqueias, que são escuras, são visíveis. Em pernas mal fixas, o material escuro está presente no tarso e na tíbia e o sistema traqueal não é claramente visível no fêmur e coxa.
O procedimento que descrevemos aqui supera o desafio de detectar expressão fluorescente em axônios de neurônios motores através de uma cutícula espessa e auto fluorescente com alta resolução. Assim, o sinal fluorescente limpo e detalhado obtido nos permite visualizar e quantificar a característica tridimensional das arbors de axônio usando programas de imagem 3D. Então essa técnica nos permitirá usar o Drosophila adulto como modelo não só para estudar o desenvolvimento do neurônio motor, mas também para estudar, para entender o impacto de doenças degenerativas como o ERAS no sistema locomotor integrado.
