O medido é usado para realizar sequenciamento chip eficiente de proteínas éster e não-éster em tecido lipídico marrom isolado do rato. A principal vantagem da técnica é que o protocolo foi otimizado para uma imunoprecipitação eficiente do complexo associado à cromatina a partir do tecido lipíduo. Antes da incisão, pulverize o rato eutanizado com 70% de etanol.
Coloque o mouse de costas para cima e faça uma incisão ao longo do pescoço. Em seguida, localizado BAT diretamente sob a pele entre os ombros e remova cuidadosamente a fina camada de gordura branca. Cruze cada bat pad em 10 mililitros de PBS contendo 1%de formaldeído por 15 minutos a 150 RPM em temperatura ambiente.
Após 15 minutos, sacie a ligação cruzada adicionando 2,5 glicina molar ao BAT, resultando em uma concentração final de 125 mililitros. Coloque-o em um agitador por cinco minutos, girando a 150 RPM em temperatura ambiente. Posteriormente, transfira a almofada BAT para 500 microliters de tampão de lise hipotônica e adicione duas contas de aço inoxidável para cada almofada BAT.
Em seguida, use um homogeneizador de tecido à base de contas para triturar o tecido. Comece com cinco minutos na potência máxima. Se necessário, estenda o tempo até que o tecido seja homogeneizado e as células únicas sejam separadas.
Transfira a amostra para um novo tubo, e centrífuga a quatro graus Celsius a 16.000 G por 10 minutos. Após 10 minutos, transfira o supernante para um novo tubo e mantenha a pelota de célula no gelo. Centrifugar o supernante a quatro graus Celsius a 16.000 G por 10 minutos para evitar a perda de células flutuantes.
Em seguida, descarte o supernascer final e suspenda novamente as duas pelotas de células juntas em 300 microliters de tampão de lise SDS com um inibidor de protease uma vez. Incubar no gelo por 10 minutos. Em seguida, sonicar os lises para gerar fragmentos de DNA de 200 a 500 pares de base de comprimento.
Após a sônicação, remova os detritos por centrifugação por 10 minutos a 16.000 G a quatro graus celsius. Para realizar a imunoprecipitação, mantenha 1% da solução de cromatina de lado como a entrada ChIP e mantenha as entradas durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, adicione o anticorpo ChIP a um mililitro de solução de cromatina e realize a imunoprecipitação paralela com IgG pré-imune correspondente ou IgG normal da mesma espécie.
Alternativamente, salve um mililitro de solução de cromatina para um controle sem anticorpos. Incubar durante a noite a quatro graus Celsius com rotação. Para coletar os complexos imunológicos, adicione 50 microlitadores de proteína A agarose 50% de chorume aos complexos imunológicos e incubar por uma hora a quatro graus Celsius com rotação a 150 RPM.
Depois de uma hora, pelota as contas por centrifugação por um minuto a 1000 vezes G a quatro graus Celsius. Realize lavagens sequenciais das contas em colunas de filtro centrífugo PVDF de 0,45 micrômetros com buffers de corda crescente, transferindo primeiro as contas nas colunas com 500 microliters de tampão de lavagem de sal baixo. Em seguida, pelota as contas nas colunas por três minutos a 2500 G.Descarte o fluxo-through.
Repita a lavagem com tampão de lavagem de sal alto de acordo com os procedimentos de lavagem de sal baixo. Em seguida, repita os procedimentos com cloreto de lítio e, finalmente, com uma vezes TE. Depois que as lavagens são concluídas, elute os complexos imunológicos adicionando 300 microliters de tampão de eluição às contas pelleted nas colunas. Incuba-os à temperatura ambiente por 30 minutos em um shaker a 400 RPM.
Posteriormente, colete o elto girando as colunas por três minutos a 2500 G em um tubo fresco. Inverta os cruzamentos incubando o elto e as entradas coletadas a 65 graus Celsius durante a noite. Para recuperar o DNA, adicione 300 microliters de clorofórmio fenol IAA ao elto e entradas em uma proporção de um para um e vórtice por 10 segundos.
Em seguida, gire para baixo a 21.000 G a quatro graus Celsius por 20 minutos. Fique com a pelota e descarte o supernasce. Lave a pelota com um mililitro de etanol frio de 70%.
Em seguida, gire para baixo a 21.000 G a quatro graus Celsius por cinco minutos. Descarte o supernatante e o ar seque a pelota. Suspenda a pelota em 70 microliters de água livre de DNAse para procedimentos adicionais.
Aqui está um exemplo de ChIP Q PCR usando BAT isolado de wildtype ou GPS2-A knockout mouses. Uma vez que o GPS2 foi considerado necessário para a expressão de genes mitocondriais codificados nucleares em diferentes linhas celulares, o recrutamento de GPS2 foi testado em dois genes mitocondriais codificados nucleares específicos. NDUFV1 e TOMM20 em BAT de camundongos como exemplos de um tecido altamente enriquecido em mitocôndrias.
A ocupação do promotor GPS2 foi comparada em ratos de nocaute GPS2-A e companheiros de letras do tipo selvagem. Uma redução esperada foi observada na ligação GPS2 em genes-alvo seletivos no BAT de ratos eliminatórios GPS2-A. Usando o protocolo descrito aqui, uma ligação aumentada de RNA polimerase dois e a marca de histona repressiva, H3K9ME3, foi registrada no BAT de ratos de nocaute GPS2-A em comparação com companheiros de letras do tipo selvagem.
Esses resultados confirmam o recrutamento de GPS2 em genes mitocondriais codificados nucleares selecionados e mostram que o GPS2 é necessário para evitar o acúmulo de H3K9ME3 e, portanto, necessário para a paralisação da atividade transcricional do polo dois em promotores-alvo. O protocolo aqui descrito, mesmo que especificamente otimizado para o tecido adiposo marrom, representa uma ferramenta valiosa para a realização de ChIP de outros tecidos murinos e humanos. Não se esqueça que trabalhar com fenocloroforme pode ser extremamente perigoso.
Portanto, é extremamente importante sempre operar sob o capô da fumaça enquanto usa este reagente.
