A caracterização da ligação proteica ao RNA in vivo continua sendo um grande desafio devido à natureza complexa do RNA e aos muitos fatores que afetam sua interação com proteínas. A proteína de ligação RNA ou afinidade RBP-RNA é medida dentro de células bacterianas vivas. Uma vez que o ambiente celular afeta tanto a estrutura do RNA quanto a consequente ligação RBP-RNA, medir a afinidade in vivo é crucial para entender tais interações em sistemas naturais.
O segredo do sucesso está no projeto dos plasmídeos. O design deve usar várias ondas de delta e evitar a inserção de códons stop e mutações de mudança de quadro. Inicie este protocolo projetando o do site de ligação.
Cada mini gene contém um local de restrição de EagI, 40 bases da extremidade cinco prime do gene de resistência à kanamicina, o promotor pLac/Ara, o site de ligação ribossosome, AUG do gene mCherry, um espaçador, um site de ligação RBP, 80 bases da extremidade principal do gene mCherry, e um local de restrição ApaLI. Para aumentar a taxa de sucesso do ensaio, projete três de site de ligação para cada local de ligação com espaçadores compostos por pelo menos uma, duas e três bases. Digerir duas vezes os mini genes e o vetor alvo com EagI HF e ApaLI antes de realizar a purificação da coluna dos digestores.
Ligate os mini genes digeridos à espinha dorsal do local de ligação contendo o resto do gene repórter mCherry, exterminador e um gene de resistência à kanamicina. Em seguida, transforme a solução de ligadura em Escherichia coli top 10 células. Depois de identificar transformadores positivos via sequenciamento Sanger, armazene plasmídeos purificados no formato 96 bem a menos 20 graus Celsius.
Também armazene as cepas bacterianas como estoques de glicerol no formato 96 bem a menos 80 graus Celsius. Peça personalizada a sequência RBP necessária sem um códon de parada como um mini gene de DNA de dupla mente com locais de restrição nas extremidades. Transforme os plasmídeos preparados em células bacterianas quimicamente competentes que já contêm um plasmídeo RBP mCerulean.
Para economizar tempo, aplaque as células usando uma pipetter de oito canais em oito placas de pista contendo ágar Luria-Bertani com antibióticos relevantes. Colônias devem aparecer em 16 horas a 37 graus Celsius. Selecione uma única colônia para cada duplo transformador e transfira para 48 placas de poço contendo 1,5 mililitros de LB com antibióticos apropriados.
Cresça as células durante um período de 18 horas a 37 graus Celsius tremendo a 250 RPM. Armazene as pernoites como estoques de glicerol a menos 80 graus Celsius em 96 placas de poço. Pela manhã, programe o robô para aquecer 180 microliters de semi-poros médio ou SPM em 96 placas de poço.
Programe o robô para preparar a placa indutora. Em uma placa limpa de 96 poços, prepare poços com SPM composto por 95%BA e 5%LB. O número de poços corresponde ao número desejado de concentrações indutoras.
Adicione C4-HSL aos poços na placa indutora que conterá a maior concentração de indutores. Em seguida, programe o robô para diluir em série o meio de cada um dos poços de maior concentração em 23 concentrações mais baixas que variam de zero a 218 nanomolar. O volume de cada diluição indutora deve ser suficiente para todas as cepas.
Para diluir as cepas durante a noite, programe o robô para diluir por um fator de 10 misturando 20 microliters de bactérias com 180 microliters de SPM em 48 placas de poço. Em seguida, diluir novamente por um fator de 10, tomando 20 microliters da solução diluída para a placa de tensão pré-preparada adequada para medição fluorescente. Agora programe o robô para adicionar o indutor diluído da placa indutora às 96 placas de poço com as cepas diluídas de acordo com as concentrações finais.
Agite as 96 placas a 37 graus Celsius por seis horas. Durante esse tempo, faça medições da densidade óptica ou OD a 595 nanômetros, bem como mCherry e fluorescência mCerulean através de um leitor de placas a cada 30 minutos. Para fins de normalização, meça o crescimento da SPM sem células adicionadas.
Aqui são tramas tridimensionais para uma tensão positiva. As tramas retratam níveis de OD brutos, fluorescência mCerulean e fluorescência mCherry em função do tempo e concentração de indutor. os níveis de expressão de estado estável mCerulean foram computados para cada concentração de indutor para as cepas positivas e negativas.
A taxa de produção mCherry também foi calculada para cada concentração de indutor para cepas positivas e negativas. A taxa de produção de mCherry foi plotada em função da fluorescência média mCerulean média acima de duas duplicatas biológicas para duas cepas. O ajuste KRBP usando a fórmula de montagem é mostrado para a cepa positiva que exibe uma resposta de ligação específica.
Para a cepa negativa, nenhum valor KRBP foi extraído. Foram determinadas curvas de resposta de dose normalizadas para 30 cepas diferentes com base em dois RBPs como 10 locais de ligação em locais diferentes. São observados três tipos de respostas, alta afinidade, baixa afinidade e nenhuma afinidade.
Aqui são mostrados resultados quantitativos krbp para dois RBPs, proteína de casaco MS2 e proteína de casaco PP7 com 10 diferentes do local de ligação. Curvas de resposta de dose para proteína de casaco MS2 com um local de ligação mutante em quatro locais diferentes são mostradas aqui para demonstrar o efeito do espaçamento mutante na produção mCherry. A sequência do local de ligação mutante testado é mostrada.
É importante usar uma técnica estrutural como a forma buscar sondar quimicamente a estrutura do complexo proteína-RNA e visualizar quais regiões de mRNA são afetadas pela ligação RNA. Recentemente, usamos essa técnica de forma de alto rendimento para medir simultaneamente a afinidade dos RBPs a 10.000 locais de vinculação.
