A maioria das linhas de milho não pode ser geneticamente transformada usando protocolos convencionais de transformação. Aqui, descrevemos um método de transformação quickcorn que é rápido e menos dependente do genótipo. O método QuickCorn utiliza os fatores de transcrição de milho BABY BOOM e WUSCHEL.
Quando incorporados no sistema vetorial de transformação, esses genes trabalham sinergicamente para estimular o crescimento embrionário. Ao contrário dos protocolos convencionais de transformação do milho, o método QuickCorn não envolve um passo de indução de calo durante a transformação. A região T-DNA do vetor binário usado em nosso trabalho contém três componentes-chave, genes morfogênicos, genes marcadores e o sistema de recombinação cre/loxP.
O sistema de recombinação de cre/loxP induzido pelo calor foi incluído no T-DNA para remover os genes morfógenos do genoma do milho para permitir a regeneração normal do calo no desenvolvimento das plantas. Cerca de dois a três dias após a escolhamento das sedas e se o pólen estará disponível no dia seguinte, corte as sedas e a casca com uma tesoura esterilizada com 70% de etanol, cerca de 2 centímetros e meio abaixo da extremidade das folhas da casca, onde as sedas emergem, e cubra a seda com um saco de tiro. Uma vez que os anteras emergem de um tassel, cubra o tassel com um saco de tassel, e coloque um clipe de papel não derrapado na base do saco ao redor do talo.
Na manhã seguinte à colocação do saco de tassel, dobre suavemente a planta e bata no saco para incentivar a liberação do pólen. Em seguida, retire o saco de tassel e dobre a parte superior do saco para evitar que o pólen escape. Para polinizar uma planta receptora, exponha as sedas e despeje rapidamente o pólen do saco de tassel nas sedas.
Cubra imediatamente a orelha polinizado com o saco de tassel, e fixe a base do saco ao redor do talo com grampos. Para verificar o tamanho imaturo do embrião, nove a 12 dias após a polinização, puxe suavemente a casca para expor os grãos em cerca de 1/3 a 1/4 da circunferência da orelha e cerca de 1/3 da distância para baixo da orelha. Use um bisturi para cortar a tampa de um único kernel que pareça semelhante à maioria dos outros grãos em tamanho e cor, e use uma espátula com uma régua para extrair o embrião.
Em seguida, use a régua ou uma pinça para medir o comprimento do embrião. Dentro de um a quatro dias de colheita, remova as cascas e sedas das orelhas colhidas e insira uma alça apropriada na parte superior ou na base de cada orelha. Submergir as orelhas em um grande recipiente de solução de alvejante de desinfecção em um capô de fluxo laminar estéril com a alça voltada para cima.
Após 20 minutos, enxágue as orelhas três vezes com um volume generoso de água fresca estéril destilada por cinco minutos por lavagem antes de permitir que as orelhas sequem por vários minutos. Em seguida, encha um tubo de microcentrifuge de dois mililitros por orelha com meio líquido de 700A e use um bisturi estéril para remover o topo de um a dois milímetros de cada coroa de kernel para expor o endosperm da orelha. Localize o embrião imaturo dentro do kernel na lateral de frente para a ponta da orelha, perto do acessório à espiga.
Para os operadores de topo e destros, descanse a orelha em uma grande placa de Petri estéril, e insira uma micro espátula no endosperm no pericarp mais distante do embrião. Torça suavemente para cima para desalojar o endosperm e expor o embrião, e use a espátula para colocar cuidadosamente o embrião em um tubo de meio líquido 700A. Para os operadores do manipulador de base que seguram a orelha com a mão esquerda, insira uma micro espátula no endosperm no pericarp mais distante do embrião, e gire suavemente para cima para desalojar o endosperm.
Para cultivar os embriões em uma cultura de suspensão de Agrobacterium, coletar bactérias de uma placa de trabalho recém-preparada em 10 mililitros de meio líquido 700A e vórtice para suspender completamente a cultura das bactérias. Meça a densidade óptica em um comprimento de onda de 550 nanômetros, e lave os embriões com um mililitro de meio 700A fresco. Mergulhe os embriões em um mililitro de suspensão agrobacterium, e vórtice em um ajuste baixo por 30 segundos.
Fixar os embriões no banco com os tubos em uma orientação horizontal por cinco minutos antes de transferir todo o conteúdo de cada tubo para placas individuais de meio de co-cultivo de 562V. Gire suavemente as placas para distribuir os embriões uniformemente, e aspire o excesso de suspensão agrobacterium. Oriente cuidadosamente os embriões com o lado em forma de cúpula voltado para cima, tomando cuidado para evitar danificar os embriões.
Em seguida, coloque placas em caixas plásticas para uma incubação durante a noite a 21 graus Celsius no escuro. Na manhã seguinte, transfira cuidadosamente embriões infectados para o meio de repouso 605T, coloque cerca de 30 embriões por placa, lado scutellum para cima, para uma incubação de quatro a 10 dias a 26 graus Celsius no escuro. Em torno de sete dias, o desenvolvimento de embriões somáticos pode ser observado na superfície do scutellum zigoótico.
Ao final do período de descanso, coloque a caixa de embriões em uma incubadora Celsius de 45 graus com umidade relativa de 70% por duas horas, seguida por uma incubação de uma a duas horas a 26 graus Celsius no escuro. Ao final da incubação, coloque de 10 a 15 embriões imaturos chocados com calor em placas individuais de formação de brotos complementados com 05 miligramas por litro do imazapyr herbicida como agente seletivo. Remova cuidadosamente os coleoptiles conforme necessário, e devolva os embriões à incubadora escura de 26 graus Celsius por duas semanas.
No final da incubação, transfira cerca de oito pedaços de tecido por placa em placas médias de raiz para uma incubação de uma a duas semanas com 16 horas de luz e oito horas de escuridão a 27 graus Celsius. À medida que as plantações se desenvolvem, coloque uma plantação mais forte contendo brotos e raízes vigorosas em placas individuais de meio de enraizamento sob luz por mais sete a 14 dias. Permitir que brotos que não sejam totalmente desenvolvidos sejam incubados no mesmo meio por mais uma a duas semanas até que estejam prontos para serem movidos para o solo.
À medida que a planta se torna mais vigorosa, enxágue as raízes com água da torneira para remover o ágar. Em seguida, transplante as plantas individuais em potes de três polegadas contendo um substrato sem solo pré-molhado em uma bandeja com furos de drenagem, e coloque a bandeja em uma câmara de crescimento com ou sem uma cúpula de umidade plástica. Nove a 14 dias após a transferência de maconha, transplante cada planta com solo em um pote de 1,5 galão.
Adicione um fertilizante de liberação controlada ao pote e mantenha as plantas na estufa. Quando os brotos de ouvido começarem a emergir da planta, use um saco de tiro semitransparente para cobrir os brotos para que as sedas emergentes possam ser observadas sem remover o saco. Em seguida, polinizar as plantas no estágio apropriado de desenvolvimento, como demonstrado.
As orelhas de milho são geralmente colhidas de nove a 12 dias após a polinização. Embriões imaturos com comprimentos que variam entre 1,5 e 2 milímetros são as melhores explantes para transformação para este protocolo. Oito dias após a infecção, embriões somáticos que expressam ZsGreen podem ser visualizados por microscopia de fluorescência.
Tratamento térmico oito dias após a infecção induz a expressão cre recombinase, resultando na excisão do gene morfogênico, cre e de expressão ZsGreen flanqueados entre os dois locais de loxP. Após três a quatro semanas de cultura em meio de formação de broto contendo herbicida, podem ser observados tecidos proliferando com embriões maduros ou brotos resistentes ao herbicida. Alguns dos tecidos resistentes a herbicidas podem ser negativos para zsgreen, sugerindo que a excisão mediada por creção provavelmente ocorreu nesses tecidos.
Depois de mover os tecidos para a incubação de média e luz, podem ser colhidas brotos saudáveis, vigorosos e crescentes com raízes bem desenvolvidas. Observe que alguns tecidos podem parecer ter vários brotos possivelmente devido a plantas clonais com padrões de integração transgênica idênticos. O método QuickCorn pode melhorar muito a eficiência da transformação do milho e expandir a lista de genótipos transformáveis.
O protocolo pode ser reproduzido com sucesso por pesquisadores com treinamento mínimo de transformação de milho. Usando o método QuickCorn, as plantas enraizadas devem estar prontas para serem transferidas para o solo em apenas cinco a sete semanas após o dia da infecção. Preste atenção à composição média, ao tempo das subculturas e às condições de temperatura e iluminação.
A qualidade dos materiais iniciais também é essencial para uma transformação bem sucedida. Os produtos químicos, a solução de alvejante e o herbicida usado neste protocolo são de risco biológico. Certifique-se de usar o equipamento de proteção pessoal apropriado durante seu uso.
