Este trabalho foi apoiado pelo Fraunhofer EUA Centro de Biotecnologia Molecular, iBio, Inc. e de Projetos de Pesquisa Avançada Agência de Defesa (concessão # HDTRA1-07-C-0054). Os autores reconhecem as generosas doações por drs. Stanton Gelvin de Ciências Biológicas Departamento da Universidade Purdue (Agrobacterium tumefaciens cepas) e Wayne Fitzmaurice de Large Scale Biology Corp (N. excelsiana sementes), assim como Jennifer Nicholson of EUA Coleção Nicotiana, North Carolina State University (N. sementes maravalhas ). Os autores agradecem a Margaret Shillingford e Christopher casco para fornecer plantas e excelente assistência técnica. Os autores também agradecer as Dras. Stephen Streatfield e Natasha Kushnir de assistência editorial.

1. Planta cresce Para agroinfiltration subseqüente avaliamos dois do tipo selvagem Nicotiana espécies (N. benthamiana e N. maravalhas) e um híbrido (N. excelsiana) cultivo hidropônico em lã de rocha em instalações internas. <ol><li> Mergulhe lã de vidro em uma solução de fertilizante de plantas. </li><li> Semear tipo selvagem N. benthamiana, N. Excelsior e N. excelsiana (híbrido de N. benthamiana × N. excelsior) nos nutrientes embebido superfície lã de rocha. </li><li> Cultive plantas das sementes em condições controladas (24 ° C e 40-65% de umidade relativa) e fotoperíodo longo dia (14 horas de luz e 10 horas escuro, com iluminação de 130-150 μE m -2 s -1) para 4-5 semanas para N. benthamiana e N. excelsiana, e 5-6 semanas para N. Excelsior. </li></ol> 2. Construção de Vetores para Agroinfiltratíon <ol><li> Inserir um gene repórter sintético (proteína fluorescente verde [GFP]), de comprimento completo da hemaglutinina (HA) a partir da estirpe do vírus da gripe A/CALIFORNIA/04/2009 (HAC1), e enzima liquenase reengenharia (LicKM) 18 separadamente em o vetor de lançamento pBID4 18 (vector-based TMV) para obter pBID4-GFP, pBID4-HAC1 e pBID4-LicKM, respectivamente 18,32,41,47. </li><li> Introduzir 10-50 ng de pBID4 realização GFP ou HAC1 em células electrocompetentes de A. tumefaciens GV3101 estirpe e LicKM em células electrocompetentes de A. Agrobacterium estirpes GV3101, C58C1, GLA4404, AT06, AT10, At77 e A4 com o electroporador MicroPulser gene. </li><li> Use o Agrobacterium transformado por experiências de infiltração salvo indicação em contrário. </li></ol> 3. Vácuo Infiltração de Agrobacterium em Nicotiana Plantas <ol><li> Crescer A. Agrobacterium cepas durante a noite (O / N) em meio LB, med Yebium ou meio AB suplementado com 50 mg / l de canamicina a 28 ° C com agitação a 200-250 rpm. </li><li> Diluir Agrobacterium em água Milli-Q a uma densidade óptica a 600 nm (A 600) de 0,5 ou centrífuga Agrobacterium células cultivadas em meio LB ou YEB ou AB a 4000 × g durante 10 min a 4 ° C, re-suspensão em meio de indução (sal 1x MS, MES 10 mM, 200 ^ M de acetosiringona, 2% de sacarose [MMA]) a A 600 de 0,5, e agita-se à temperatura ambiente durante 1-3 hr, salvo indicação em contrário. </li><li> Infiltrar plantas em uma câmara de vácuo, submergindo Nicotiana plantas tecidos aéreos em suspensão Agrobacterium e aplicação de um vácuo 50-400 mbar por 30 ou 60 seg. A infiltração ideal é rotineiramente aplicada em 50-100 mbar por 60 seg. </li><li> Uma vez que o vácuo é quebrado, remover as plantas da câmara de vácuo, lavar com água, e crescer durante 5-7 dias, sob as mesmas condições de crescimento usadas para o crescimento de pré-infiltração. </li><li> Para testar a eficáciade produtos químicos indutores do gene vir Agrobacterium, diferentes concentrações de acetossiringona (0, 100, 200 ou 400 pM) foram adicionados para o Agrobacterium suspenso em tampão de infiltração (1x MS, MES 10 mM, 2% de glicose). Para o efeito de monossacárido na indução de genes vir, percentagens diferentes de glicose (0, 1, 2 ou 4%) foram adicionados a Agrobacteria suspenso no tampão de infiltração (1x MS, MES 10 mM, 200 ^ M de acetosiringona). N. plantas benthamiana foram infiltradas como mencionado acima em passos 3.3 e 3.4). </li><li> Laboratório estirpes GV3101 de Agrobacterium, C58C1 e LBA4404 e as estirpes do tipo selvagem A4, AT06, AT10, At77 e abrigando o vector pBID4-LicKM foram diluídos em água Milli-Q a A 600 de 0,5. N. plantas benthamiana foram infiltradas com cada estirpe particular, como mencionado acima, em passos 3.3 e 3.4. </li></ol> 4. Processo de co-agroinfiltration para o silenciamento do supressor Viral <ol><li> Mix as diluído em água Milli-Q culturas Agrobacterium GV3101 portadores do gene GFP eo silenciamento viral p19 supressor de tomate vírus enfezamento vermelho (TBSV) em 1:1, 2:1, 3:1 e 4:1 rácios. Infiltrar N. benthamiana plantas, como descrito acima. </li><li> Infiltrar N. benthamiana plantas com uma mistura de dois diluída em água GV3101 de Agrobacterium culturas Milli-Q: a primeira portadora do plasmídeo pBID4-HAC1 e a segunda realização um dos eliminadores de silenciamento - p19 de TBSV ou p23 do vírus da tristeza dos citrinos, no plasmídeo pCassp ( pCassp19) e no plasmídeo binário PGR sob o promotor 35S (PGR-P23), respectivamente, na proporção de 4:1. </li></ol> 5. Ocidental Análise Blot <ol><li> Coletar amostras de folhas aleatórias de N. benthamiana, N. excelsior ou N. plantas excelsiana em 4-7 dpi e pulverizar em nitrogênio líquido a um pó fino. </li><li> Adicionar três volumes de tampão de PBS 1x contendo 0,5% de TritonX-100 a cada uma das amostras. </li><li> Agite suavemente as amostras extraídas por 15 min a 4 ° C. </li><li> Gire o extrato por 5 min e recolher proteínas solúveis totais em um tubo Eppendorf limpo. </li><li> Dilui-se os extractos a uma diluição adequada (1:50 a 1:100) em tampão de extracção de 1x PBS, e adicionar 5 × tampão de amostra (250 mM Tris-HCl [pH 6,8], 10% de SDS, 0,5% de azul de bromofenol, 50% de glicerol v / v, e DTT a 500 mM) a uma concentração final de 1 ×. </li><li> Amostras ferva por 5 min. </li><li> Proteínas separadas por 10% SDS-PAGE, transferência para membrana de transferência Immobilon-P, e bloqueá-lo com 0,5% I-bloco. </li><li> Detectar GFP utilizando anticorpo policlonal de coelho anti-anti-soro de 1:5000 GFP e HAC1 usando o rato de anticorpo monoclonal anti-poli-histidina na 1:1000 em solução de bloqueio durante 1 hr. </li><li> Após marcação com anticorpos primários, lavar as membranas três vezes durante 10 minutos cada um com 1 × PBST-20 e incubar com uma peroxidase de rábano (HRP) conjugado com anticorpo anti-coelho a 1:5000 ou um HRP-conjugadod anticorpo anti-rato 1:10000 durante 1 hora, para GFP e detecção HAC1, respectivamente. </li><li> Processe Western blot utilizando o substrato quimioluminescente SuperSignal West Pico. </li><li> Usar o Software GeneTools analisar intensidade da banda da proteína e obter a quantidade calibrada banda. </li></ol> Produção de proteínas: (Calibrado quantidade x de diluição da amostra) / quantidade de amostra carregada) x = 4 mg / kg. Equação: produção de proteína (P), a quantidade calibrada (C), A diluição da amostra (D) e a quantidade de amostra carregados (S). 6. Zimograma Ensaio <ol><li> N. Colete pBID4-LicKM-se infiltrado benthamiana amostras de tecido aleatório. </li><li> Extrair proteínas utilizando os mesmos métodos acima descritos para análise de Western blot e, em seguida, analisar por 10% de SDS-PAGE com 0,1% liquenano incluídos nos géis. </li><li> Após a electroforese, os géis de lavar duas vezes durante 10 minutos cada em tampão de lavagem (Tris-HCl 100 [pH 8,0] e 0,1% de Triton X-100) E depois incubar, em tampão de lavagem a 65 ° C durante 1 hora. </li><li> Após incubação, eliminar o tampão de lavagem e manchar os geles com 0,5% de Vermelho do Congo, durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar os géis em água Milli-Q três vezes durante 10 minutos cada, e adicionar 1 M de NaCl para visualizar a actividade liquenase. A liquenase purificada de proteína bacteriana foi utilizado como um controlo positivo para a actividade da enzima. </li></ol> 7. GFP Imagem <ol><li> Realizar a detecção visual de fluorescência da GFP em plantas transformadas transitoriamente inteiros usando um longo comprimento de onda da lâmpada UV de mão. </li><li> Fotografia transitoriamente transformado plantas com uma câmera digital através de um Amarelo 8, ES 52 filtro (tempo de exposição, 15 seg). </li><li> Obter imagens de Western blot usando o software GeneSnap em um GeneGnome e quantificar os resultados usando o software GeneTools, com uma curva de calibração com base no padrão GFP purificada. </li><li> Quantificar proteína HAC1 usando uma curva de calibração baseada em purificaçãoed HAC padrão de proteína a partir da estirpe do vírus da gripe A/Indonesia/05/05. </li><li> Calcule os valores médios 3-4 replica para todos os experimentos. </li></ol>

Não temos nada a divulgar.

No presente estudo, nós desenvolvemos um protocolo agroinfiltration simples para a produção de proteína transiente rotina em espécies de Nicotiana seleccionados utilizando estirpes de Agrobacterium portadoras do vector de lançamento. Além disso, identificamos as melhores condições para atingir o mais alto nível de produção de proteínas recombinantes em nosso sistema de expressão transitória da planta. Infiltração de vácuo do A. diluído tumefaciens GV3101 tensão abrigar os pBID4 vetores de lançamento em N. benthamiana, N. excelsiana e N. Excelsior resultou em níveis mais elevados de produção da proteína alvo dentro de 7 dpi em comparação com outras espécies de plantas, tais como Pisum sativum infiltrada com GV3101 abrigando vírus do mosaico da alfafa - ou mosaico do pepino vectores à base de vírus que expressam o gene repórter da GFP sob o promotor 35S 41, ou Lactuca sativa, Solanum LycoPersicum e Arabidopsis thaliana infiltrada com a cepa C58C1 de A. tumefaciens transportando o gene repórter beta-glucuronidase 57. N. benthamiana e N. excelsiana eram fáceis de aspirar infiltrar a 50 mbar para 30-60 segundos, com 90-95% de eficiência de infiltração. Os restantes 5-10% de área foliar não foi infiltrado por causa de alguma flutuação das folhas na superfície da suspensão de Agrobacterium durante a aplicação do vácuo. Uma vez que o vector de lançamento tem capacidade para célula-a-célula de circulação 18, a acumulação de proteína transiente ocorre em folhas inteiras, bem como em pecíolos 7 dpi. Aos 10 dpi, a produção estimada GFP foi um pouco menor, porque o vetor de expressão pBID4 é capaz de se mover de uma célula para outra, mas não se mover sistemicamente 18; por conseguinte, as folhas recentemente cultivadas não contêm o vector e não contribuem para a produção de alvo. Além disso, a degradação da proteína recombinante com o tempo may contribuir para o nível de proteína reduzida a 10 dpi. Os nossos resultados mostraram que a infiltração do A. elevados níveis de Agrobacterium estirpe GV3101 mediadas de produção de proteína transiente em N. benthamiana. Além disso, a proteína alvo pode ser manipulada como, fusões N-terminais C-terminais ou internos para liquenase (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glucanase, que é uma enzima termoestável de Clostridium thermocellum e confere termoestabilidade a muitos alvo proteína de fusão 18. Infiltração de N. benthamiana com A. tumefaciens cepas do tipo selvagem (AT6, AT10 e at77) abrigando o gene de interesse provocou sintomas leves ou graves: ondulação, pecíolo de alongamento, e curling. Sem sintomas patológicos foram observadas em N. benthamiana infiltrada com o GV3101 cepa de laboratório abrigar vazio vetor pBID4, enquanto que alguns genes inseridos em pBID4 e transformado em laboratório cepas GV3101, C58C1 ou LBA4404 provocou reações necróticas suaves e folhaclorose / sintomas de amarelecimento nas regiões infiltradas de folhas. Sintomas necróticas causadas por tipo selvagem Agrobacterium ou cepas desarmados em solanáceas foram relatados anteriormente 56,57. A resposta necrótica pode resultar a partir de factores de virulência do sistema de secreção de tipo III, proteínas de bactérias transferidas para a célula da planta por o sistema de secreção de tipo IV, e / ou sensibilidade de flagelina 58-60. Verificou-se que a produção transiente de proteínas heterólogas podem também induzir patogenicidade e uma resposta de hipersensibilidade em planta infiltrada folhas. Muitos pesquisadores relataram que agroinfiltration de diferentes espécies de plantas com vetores binários de plantas produzidas até 5-20 vezes maiores níveis de produção de proteína transitória, em comparação com as plantas estavelmente transformadas 28,57. Nossos dados mostram que N. benthamiana infiltrada com GV3101 abrigando pBID4-GFP elevados níveis expressos transitoriamente de GFP, a qual é semelhante à relatada para a produção de GFPN. benthamiana infiltrada com Agrobacterium transportando o vector viral Pich-GFPSYS (até 80% da proteína solúvel total) 44. Agroinfiltration usando o lançamento vector resultou em elevada produção da proteína LicKM termoestável, 50 vezes mais elevada do que a observada usando um plasmídeo binário padrão 18. Para testar a capacidade de infecção de A. tumefaciens e a estabilidade do vector de lançamento, infiltra-se um plano de N. benthamiana a cada hora durante até 8 horas, utilizando o mesmo Milli-Q cultura diluído em água de GV3101 albergando o plasmídeo pBID4-GFP. Nossos dados mostraram que a cepa GV3101 é eficientemente infectante por pelo menos 8 horas e pBID4 (o vetor de lançamento) é muito estável durante o longo 8 hr-infiltração. Stock de glicerol da estirpe GV3101 abrigando o vector de lançamento pBID4-HAC1 (banco de células), armazenado a -80 ° C foi mostrado ser muito estável durante três anos, sem alterações da prote transientena produção de plantas infiltradas. Plantas N. benthamiana cultivadas sob condições ideais e entre 35 e 42 dias após a semeadura foram ideal para expressão transitória mediada por infiltração a vácuo gene 40. Plantas jovens (3-4 semanas de idade) não pode ser infiltrada inteiramente devido a folhas que flutuam na superfície da suspensão celular e danos nos tecidos dos efeitos mecânicos de aplicação de um vácuo. Em plantas com mais de 45 dias, a N. benthamiana gazes fase, sob as condições de luz óptimas utilizadas, o nível de expressão transiente é baixo. Compostos de baixo peso molecular fenólicos (acetoseringona) e monosaccharaides (glicose) são conhecidos por induzir genes vir em A. tumefaciens 55,61. Além disso, a infiltração de N. benthamiana com o vector binário pCAMBIA (GFP), na presença de acetossiringona nas concentrações de 50-600 uM foram mostrados para aumentar ligeiramente transientea expressão do gene 40. Foram estudados os efeitos de diferentes concentrações de acetoseringona e glicose em nosso sistema, adicionando estes compostos para culturas GV3101 abrigando pBID4-GFP no MMA, durante 3 horas, e não encontraram nenhuma diferença na expressão GFP. Curiosamente, as culturas GV3101 albergando pBID4-GFP e diluído em água Milli-Q para um A 600 de 0,5 e infiltradas sem a indução do gene vir expressa as mesmas quantidades de GFP como aqueles infiltrada com culturas induzidas. A A. do gene vir Agrobacterium (s) poderia potencialmente ser induzida por compostos fenólicos de plantas (acetosiringona e ácido sinapinico) e monosaccharaides vegetais (glucose e frutose) presentes no tecido da folha. Portanto, especula-se que os níveis semelhantes de expressão da GFP na presença ou ausência de indutores de genes vir exógenos pode ser um resultado de o efeito de indutores de gene vir citoplasmáticos presentes durante a replicação do vector de lançamento que expressam GFP em células de plantas. N. benthamiana tem sido utilizada como um modelo hospedeiro para a produção da proteína transiente 49. No entanto, relativamente baixa produção de biomassa N. benthamiana &#39;s dificulta a sua aplicação para a produção em larga escala de proteínas recombinantes. O hospedeiro ideal deve combinar um elevado nível de expressão transiente, fácil de crescimento numa estufa, e ser susceptível de Agrobacterium infiltração 2. Para selecionar um hospedeiro alternativo, infiltra-se duas espécies do tipo selvagem diferentes de Nicotiana (N. benthamiana e N. excelsior) e um híbrido N. excelsiana (N. benthamiana × N. Excelsior) com a A. tumefaciens GV3101 estirpe portadora do plasmídeo pBID4-GFP. Entre estas três espécies, o nível de expressão da GFP era ligeiramente maior em N. benthamiana. N. plantas maravalhas mostrou dificuldade em agroinfiltration vácuo, devido às suas folhas coriáceas, e N. excelsianaproduziu aproximadamente duas vezes mais a biomassa sob as mesmas condições de crescimento. A produção transitória da GFP em 7 ppp é relativamente semelhante em N. benthamiana e N. excelsiana. Portanto, N. excelsiana pode ser um hospedeiro mais adequado para produção de proteína recombinante. Produção de proteína transiente mediada por Agrobacterium é limitado por PTGS 26, que pode ser superada através da co-expressão de silenciamento de genes supressores de origem vírus de planta 62. A produção de proteínas de transientes tem sido mostrado previamente para ser aumentada 50 vezes, na presença da proteína p19 de TBSV, que inibe PTGS em tecidos infiltrados 34. Em nosso estudo, avaliou-se o efeito de dois supressores de silenciamento viral (p19 e p23) separadamente co-infiltrados com o vetor de lançamento pBID4-HAC1. A co-infiltração desses eliminadores de silenciamento pareceu ter pouca influência sobre a expressão transitória de HAC1, com apenas um ligeiro aumento na HAC1acumulação de proteína (15-25%), na presença de co-p23 ou p19 infiltrada. Para efeito positivo na produção de proteína, os supressores de silenciamento pode precisar de ser especificamente seleccionados para ser eficaz para as espécies de plantas alvo e do vetor viral 63. TMV helicase tem um supressor da actividade de RNA silenciamento 64,65. Nossos dados confirmam essa observação como co-infiltração de p23 ou p19 com pBID4-HAC1 não resultou em aumento da GFP ou um ligeiro aumento na produção de proteína HAC1 transitória. Em conclusão, podemos ter modificado e optimizado para as condições de crescimento da planta e Agrobacterium e melhorou a eficácia de infiltração por vácuo. Esta tecnologia possibilitou a crescer e se infiltrarem de centenas de quilogramas de material de planta em algumas horas. Nós automatizado com sucesso a planta técnica expressão transitória para a produção de vacinas de alto rendimento em escalas industriais sob as Boas Práticas de Fabricação (cGMP) Condições. Para mais informações aboautomação e utilização do transitório sistema de produção de proteína para a produção de proteínas recombinantes, incluindo candidatos a vacinas de subunidades, em condições de cGMP ut, os leitores são encaminhados para o site <a href="http://fhcmb.org/">www.fhcmb.org/</a> .

As plantas são agora reconhecidos como uma plataforma segura, confiável, escalável e de baixo custo para a produção de biofármacos recombinantes heterólogas e proteínas industriais 1-3 e ter vantagens importantes sobre microbianos e animais sistemas de expressão de célula 4. As plantas são capazes de expressar proteínas corretamente dobradas com modificações pós-traducionais, incluindo anticorpos multiméricas montados 5-7. Várias proteínas farmacêuticas recombinantes derivadas de plantas são submetidos a avaliação clínica 8. Estes incluem vacinas específicas do paciente recombinantes idiotype (scFv) para o tratamento de linfoma não-Hodgkin 9, pandemia baseada hemaglutinina e sazonais vacinas influenza 10,11 (Cummings et al., Submetida a Vaccine), anti-Streptococcus antígeno de superfície I / anticorpo II para o tratamento de cáries dentárias de 12, e a insulina humana para o tratamento de diabetes 13. Além disso, reco humanoglucocerebrosidase mbinant para a terapia de reposição enzimática em pacientes com doença de Gaucher foi aprovada em Israel e os EUA e é fornecido sob o programa de acesso expandido fora de os EUA 14,15. Proteínas heterólogas podem ser produzidos em transformadas de forma estável (transgénico ou transplastômicas) ou plantas transformadas de forma transiente. Produção de proteína transiente oferece várias vantagens sobre a produção de plantas transgénicas, incluindo prazo curto para atingir a expressão e acumulação 16, e pode ser alcançada através da introdução de vectores binários bacterianos ou vectores virais recombinantes de plantas em tecidos de plantas 4. O sistema de expressão transiente mais avançada é baseado na utilização de &quot;vectores de lançamento&quot;, que combinam componentes de vírus de plantas e plasmídeos binários, e são entregues por agroinfiltration 17,18. Agroinfiltration de um vetor de lançamento com base em Tobacco mosaic virus (TMV) foi aplicada com sucesso em laboratórioescala para a produção de antígenos vacinais contra patógenos como o vírus do papiloma humano 19, Yersinia pestis 20, influenza vírus A 21,22, Bacillus anthracis 23, e vírus da varíola 24 em N. benthamiana folhas. expressão transiente mediada por Agrobacterium, também é um método promissor para a produção simultânea de várias proteínas 2,25-27. Por exemplo, os sistemas de expressão transiente de plantas foram usadas para produzir anticorpos recombinantes específicos de tumores 28,29, um anticorpo recombinante glicosilada contra o receptor do factor de crescimento epidérmico de 30, e um anticorpo monoclonal específico para o antigénio protector antraz 31,32. Co-infiltração de plantas de Nicotiana benthamiana com um gene alvo e um supressor de resultados silenciamento gênico em aumento da expressão da proteína-alvo 33,34. Agroinfiltration é um método comum para a introdu uniformementebactérias Cing abrigando um gene de interesse em tecidos vegetais 35-37. Infiltração de vácuo de Agrobacterium para a expressão gênica transitória na intacto folhas de plantas é um método rápido, escalável e útil para a produção de proteínas estranhas, sem a necessidade de gerar plantas transgênicas 38-41. Durante agroinfiltration vácuo, as plantas são viradas de cabeça para baixo e partes aéreas submerso em suspensão Agrobacterium. Em seguida, o vácuo é aplicado causando gases de evacuação de espaços intercelulares folha através dos estômatos. Re-pressurização após a libertação rápida dos resultados de vácuo na infusão da suspensão de Agrobacterium para a folha. Seguindo infiltração por vácuo de Agrobactérias, as plantas são depois cultivados e expressão do alvo é monitorizada. Os maiores níveis de expressão alvo são normalmente observadas 2-3 dias após a infiltração (dpi) com um vetor binário e 4-7 dpi com um vetor de lançamento, após o qual o nível de expressão tipicamente dimises 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens é o veículo mais largamente usado para a entrega de um gene de interesse em uma planta para a produção de proteína. Agroinfiltration funciona excepcionalmente bem em N. benthamiana mas relativamente mal na maioria das outras plantas, incluindo Arabidopsis thaliana 46. Neste estudo, foi desenvolvido um método simples, eficaz e económico para a produção da proteína transiente em 5-6 semanas de idade, N. benthamiana usando A. tumefaciens infiltração. A principal desvantagem da escamação industrial da técnica agroinfiltration é centrifugação das bactérias colhidas e a ressuspensão do sedimento bacteriano em meio contendo 4 &#39;-hidroxi-3&#39;, 5&#39;-dimetoxiacetofenona (acetosiringona), monossacarídeos, e 2 - (N-morfolino) ácido-etanossulfónico (MES), tampão para a indução de genes vir. Temos sido capazes de superar estes problemas através da otimização do Agrobacterium </in&gt; o crescimento em meio AB (meio mínimo) seguido por diluição directa em água Milli-Q e controlando o tempo e as condições de infiltração. Também foram comparados a produção de proteínas-alvo no N. de tipo selvagem de espécies hospedeiras tabaco benthamiana e N. aparas de madeira, bem como em N. híbrida excelsiana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana benthamiana</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555478 TW16</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsior</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555685 TW47</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsiana</td>
			<td style="width:221px;">Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA</td>
			<td style="width:119px;">LSBC EBA 042304.02</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacuum skid</td>
			<td style="width:221px;">Abbas, Ashland, MA</td>
			<td style="width:119px;">Custom made</td>
			<td style="width:236px;">Plant infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rockwool</td>
			<td style="width:221px;">Grodan Inc., Ontario, Canada</td>
			<td style="width:119px;">AO 50/40</td>
			<td style="width:236px;">Hydroponic media for growing plant</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid</td>
			<td style="width:221px;">Acros Organics, Thermo Fisher Scientific&#160; 
			NJ</td>
			<td style="width:119px;">172595000</td>
			<td style="width:236px;">Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Murashige &#38; Skoog salt (MS salt)</td>
			<td style="width:221px;">Phyto Technology Lab</td>
			<td style="width:119px;">M524</td>
			<td style="width:236px;">Tissue culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">D134406-5G</td>
			<td style="width:236px;">Agrobacterium induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Immobilon-P transfer membrane</td>
			<td style="width:221px;">Millipore, Billerica, MA</td>
			<td style="width:119px;">IPVH00010</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">I-block</td>
			<td style="width:221px;">Applied Biosystems, Foster City, CA</td>
			<td style="width:119px;">T2015</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Washington Biotechnology, Baltimore, MD&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti&#8211;poly-histidine monoclonal antibody</td>
			<td style="width:221px;">Qiagen GmbH, Hilden</td>
			<td style="width:119px;">34670</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">111-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">115-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SuperSignal&#174; West Pico chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL</td>
			<td style="width:119px;">34078</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan)</td>
			<td style="width:221px;">Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland&#160;</td>
			<td style="width:119px;">P-LICHN</td>
			<td style="width:236px;">Lichenase Activity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Congo Red&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">C6277&#160;</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Digital camera&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Olympus, Center Valley, PA</td>
			<td style="width:119px;">C-8080</td>
			<td>Chemiluminescence imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneGnome</td>
			<td style="width:221px;">Syngene, Frederick, MD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GFP standard&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Made in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plant fertilizer solution</td>
			<td style="width:221px;">Griffin Greenhouse &#38; Nursery Supplies, Newark, DE</td>
			<td style="width:119px;">67-23-20</td>
			<td>Plant growing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lichenase Standard</td>
			<td style="width:221px;">Purified in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BioRad, Hercules, CA&#160;</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>Agrobacterium transformation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization and utilization of agrobacterium-mediated transient protein production in nicotiana

Produção de proteína transiente mediada por Agrobacterium, em plantas é uma abordagem promissora para a produção de antigénios de vacina e proteínas terapêuticas dentro de um curto período de tempo. No entanto, esta tecnologia está apenas começando a ser aplicado a produção como muitos obstáculos tecnológicos de grande escala para expandir agora estão sendo superados. Aqui, nós demonstramos um método simples e reprodutível para a produção de proteína transitória em escala industrial baseado na infiltração de vácuo de plantas de Nicotiana com Agrobacterium levando vetores de lançamento. Optimização do cultivo de Agrobacterium em meio AB permite diluição directa da cultura bacteriana em água Milli-Q, simplificando o processo de infiltração. Entre três espécies testadas de Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana × N. Excelsior) foi seleccionada como o hospedeiro mais promissor, devido à facilidade de infiltração, elevado nível de produção de proteína repórter, e cerca de dois-fidade mais elevada produção de biomassa sob condições ambientais controladas. Indução de Agrobacterium abrigando pBID4-GFP (baseado no vírus do mosaico do tabaco) utilizando produtos químicos, tais como aceto-siringona e monossacárido não teve nenhum efeito sobre o nível de produção de proteína. Infiltrando planta em 50 a 100 mbar para 30 ou 60 segundos resultou em cerca de 95% de infiltração de tecidos foliares de plantas. Infiltração com GV3101 cepa de laboratório Agrobacterium apresentou a maior produção de proteína em comparação com estirpes laboratoriais Agrobacterium LBA4404 e C58C1 e do tipo selvagem Agrobacteria cepas AT6, AT10, at77 e A4. A co-expressão de um vírus de ARN de silenciamento supressor, p23 ou p19, em N. benthamiana resultou em acumulação anterior e aumento da produção de (15-25%) de proteína alvo (hemaglutinina do vírus da gripe).

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Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Produção de proteína transiente em plantas de Nicotiana baseado na infiltração de vácuo com Agrobacterium levando vetores de lançamento (Tobacco mosaic vírus-base) é uma abordagem rápida e econômica para a produção de antígenos vacinais e proteínas terapêuticas. Nós simplificamos o processo e melhorado acumulação alvo, otimizando as condições de cultivo de bactérias, a seleção de espécies hospedeiras, e co-introdução de RNA silenciar supressores.

Otimização e Utilização de<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediada produção de proteína transiente em<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

optimization-utilization-agrobacterium-mediated-transient-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

41.2K visualizações.  Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology.  Produção de proteína transiente em plantas de Nicotiana baseado na infiltração de vácuo com Agrobacterium levando vetores de lançamento (Tobacco mosaic vírus-base) é uma abordagem rápida e econômica para a produção de antígenos vacinais e proteínas terapêuticas. Nós simplificamos o processo e melhorado acumulação alvo, otimizando as condições de cultivo de bactérias, a seleção de espécies hospedeiras, e co-introdução ...

Vídeo: Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR&#945;, etc.). We are able to model and study a human-like disease in our mouse model, by transplanting bone marrow cells previously infected with a retrovirus expressing the oncogene of interest. Replication-defective retrovirus encoding a human oncogene and a marker (GFP, RFP, antibiotic resistance gene, etc.) is produced by a transient transfection protocol using 293T cells, a human renal epithelial cell line transformed by the adenovirus E1A gene product. 293 cells have the unusual property of being highly transfectable by calcium phosphate (CaPO4), with up to 50-80% transfection efficiency readily attainable. Here, we co-transfect 293 cells with a retroviral vector expressing the oncogene of interest and a plasmid that expresses the gag-pol-env packaging functions, such as the single-genome packaging constructs kat or pCL, in this case the EcoPak plasmid. The initial transfection is further improved by use of chloroquine. Stocks of ecotropic virus, collected as culture supernatant 48 hrs. post-transfection, can be stored at -80&deg;C and used for infection of cell-lines in view of transformation and in vitro studies, or primary cells such as mouse bone marrow cells, that can then be used for transplant in our mouse model.

This technique demonstrates an efficient way to prepare replication-defective retroviral stocks encoding a human oncogene, and subsequently used for induction of myeloproliferative disease in the mouse model.

Produção de retrovírus replicação defeituosa por transfecção transiente das células 293T

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Biologia

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated heavy chains that are noncovalently associated with beta2-microglobulin. They bind lipids rather than peptides. Although their structure confirms the similarity of CD1 proteins to MHC class I and class II antigen presenting molecules, the mCD1d groove is relatively narrow, deep, and highly hydrophobic and it has two binding pockets instead of the several shallow pockets described for the classical MHC-encoded antigen-presenting molecules. Based upon their amino acid sequences, such a hydrobphobic groove provides an ideal environment for the binding of lipid antigens. The Natural Killer T (NKT) cells use their TCR to recognize glycolipids bound to or presented by CD1d. T cells reactive to lipids presented by CD1 have been involved in the protection against autoimmune and infectious diseases and in tumor rejection. Thus, the ability to identify, purify , and track the response of CD1-reactive NKT cell is of great importance . The generation of tetramers of alpha Galactosyl ceramide (a-Galcer) with CD1d has significant insight into the biology of NKT cells. Tetramers constructed from other CD1 molecules have also been generated and these new reagents have greatly expanded the knowledge of the functions of lipid-reactive T cells, with potential use in monitoring the response to lipid-based vaccines and in the diagnosis of autoimmune diseases and other treatments.

A Method to prepare Insect cells and infect them with baculovirus for the the purpose of production of recombinant mCD1d proteinand generating mCD1d tetramers.

Um método para produção de proteína recombinante em células de inseto mCD1d.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Induzida por vírus silenciamento gênico (VIGS) em Nicotiana benthamiana Tomate e

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Assay silenciamento gênico Em Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

The tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the Human Protein Atlas project for global analysis of protein expression patterns in normal human tissues, cancer and cell lines. Here we present the assembly of 1 mm cores, retrieved from microscopically selected representative tissues, into a single recipient TMA block. The number and size of cores in a TMA block can be varied from approximately forty 2 mm cores to hundreds of 0.6 mm cores. The advantage of using TMA technology is that large amount of data can rapidly be obtained using a single immunostaining protocol to avoid experimental variability. Importantly, only limited amount of scarce tissue is needed, which allows for the analysis of large patient cohorts 1 2. Approximately 250 consecutive sections (4 &mu;m thick) can be cut from a TMA block and used for immunohistochemical staining to determine specific protein expression patterns for 250 different antibodies. In the Human Protein Atlas project, antibodies are generated towards all human proteins and used to acquire corresponding protein profiles in both normal human tissues from 144 individuals and cancer tissues from 216 different patients, representing the 20 most common forms of human cancer. Immunohistochemically stained TMA sections on glass slides are scanned to create high-resolution images from which pathologists can interpret and annotate the outcome of immunohistochemistry. Images together with corresponding pathology-based annotation data are made publically available for the research community through the Human Protein Atlas portal (<a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a>) (Figure 1) 3 4. The Human Protein Atlas provides a map showing the distribution and relative abundance of proteins in the human body. The current version contains over 11 million images with protein expression data for 12.238 unique proteins, corresponding to more than 61% of all proteins encoded by the human genome.

Tissue microarrays allows for an efficient method to gain concurrent information from a multitude of tissues. Representative parts of tissues are assembled into a single paraffin block. Sections from the block are used for immunohistochemistry and analysis of protein expression patterns. Digital scanning generates corresponding images for distribution of data.

Produção de Microarrays Tecido, de coloração imuno-histoquímica e de digitalização Dentro do Atlas proteína humana

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

A Plataforma de Produção de Proteína Complexo MultiBac no EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most commonly used agent for agroinfiltration is Agrobacterium tumefaciens, a pathogen of many dicot plant species. This implies that agroinfiltration can be applied to many plant species. Here, we present our protocols and expected results when applying these methods to the potato (Solanum tuberosum), its related wild tuber-bearing Solanum species (Solanum section Petota) and the model plant Nicotiana benthamiana. In addition to functional analysis of single genes, such as resistance (R) or avirulence (Avr) genes, the agroinfiltration assay is very suitable for recapitulating the R-AVR interactions associated with specific host pathogen interactions by simply delivering R and Avr transgenes into the same cell. However, some plant genotypes can raise nonspecific defense responses to Agrobacterium, as we observed for example for several potato genotypes. Compared to agroinfiltration, detection of AVR activity with PVX agroinfection is more sensitive, more high-throughput in functional screens and less sensitive to nonspecific defense responses to Agrobacterium. However, nonspecific defense to PVX can occur and there is a risk to miss responses due to virus-induced extreme resistance. Despite such limitations, in our experience, agroinfiltration and PVX agroinfection are both suitable and complementary assays that can be used simultaneously to confirm each other&#39;s results.

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are routine functional assays for transient ectopic expression of genes in plants. These methods are efficient assays in effectoromics strategies (rapid resistance and avirulence gene discovery) and crucial to modern research in molecular plant pathology. They meet the demand for robust high-throughput functional analysis in plants.

Agroinfiltração e Agroinfecção PVX em Batata e Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Luciferase complementação Imaging ensaio em folhas de Nicotiana benthamiana de transitoriamente determinação dinâmica da interação da proteína-proteína

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Otimização e Utilização de

Resumo

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