Hello.Today vamos mostrar-lhe um protocolo que protoplasta milhões de células do mesofilo de milho e as transforma em alta eficiência. As principais etapas do protocolo são, primeiramente, digerir e remover a parede celular vegetal, liberando os protoplastos, e depois transformar o protoplasto com PEG. A grande diferença entre esse protocolo e outros é a escala de transformação.
A maioria dos protocolos termina com entre 1.000 e 10.000 protoplastos transformados. No entanto, nosso protocolo fornece milhões de protoplastos de milho transformados. Aqui temos mudas de milho cultivadas no escuro por nove a 11 dias pós-germinação.
Corte as mudas logo acima do nível do solo e coloque na água. Mantenha as plantas no escuro quando não estiverem em uso. Selecione a segunda e a terceira folhas de cada muda, tomando o cuidado de excluir folhas com áreas marrons ou danificadas.
Selecione de 12 a 16 folhas e corte um centímetro das pontas. Em seguida, corte uma seção de 10 centímetros de cada folha. Empilhar seções de folhas umas sobre as outras com as extremidades basais juntas.
Aperte o feixe na extremidade basal usando um clipe aglutinante. Coloque o feixe de folhas em um pedaço de papel branco. Corte fatias de folhas com 0,5 a um milímetro de largura.
É importante cortar fatias finas e consistentes. Após o corte de parte do feixe foliar, transfira as fatias para a solução enzimática. Não deixe o material secar.
Agite suavemente a solução enzimática para molhar o material. Coloque papel alumínio sobre o copo para bloquear a luz. Repita esse processo até que todo o pacote seja cortado perto do clipe do fichário.
Após o corte, a solução deve ficar assim. Transfira o copo da solução enzimática para um frasco de sino. Infiltrar-se a vácuo durante três minutos à temperatura ambiente.
Incubar num agitador de mesa a 40 RPM à temperatura ambiente durante duas horas e meia. Após a incubação, dê um redemoinho à solução. Deve parecer leitoso, indicando uma digestão bem-sucedida.
Incubar no agitador de mesa a 80 RPM à temperatura ambiente durante mais 10 minutos. Coloque o copo com solução enzimática sobre gelo. Pare a digestão adicionando um volume de MMG gelado.
Filtre através de um filtro de células de 40 mícrons para um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Divida a solução em alíquotas de no máximo 10 mililitros cada. Despeje em tubos de vidro de fundo redondo refrigerado.
Centrifugar os tubos a 100 G durante quatro minutos. Retire o sobrenadante, certificando-se de não perturbar o pellet. Ressuspenda novamente e, em seguida, reúna amostras para lavagens subsequentes.
Lave os protoplastos duas vezes com cinco mililitros de MMG. Gire cada vez a 100 G por três minutos. O pellet deve ser uma cor verde amarela bonita e brilhante.
Você poderá ressuspender o pellet girando suavemente o tubo. Ressuspenda em um mililitro de MMG e dilua uma pequena alíquota de 10 a 20x para contagem. É importante ressuspender bem antes do aliqout, pois os protoplastos se acomodarão rapidamente.
Coloque os protoplastos diluídos no hemocitômetro. Conte os protoplastos sob um microscópio de luz. Uma boa preparação não terá muito excesso de detritos flutuando após a lavagem.
Bons protoplastos são circulares com plastídios visíveis. Use a contagem de células para calcular o número total. Essa preparação resultou em pouco mais de 10 milhões de protoplastos.
Recomendamos verificar a viabilidade usando o corante diacetato de fluoresceína. Isolamentos bem-sucedidos de protoplastos produzem a viabilidade entre 70 e 90%Misture os protoplastos com seu plasmídeo de interesse. Este exemplo usa 1 milhão de protoplastos e 15 microgramas de DNA.
Incubar no gelo por 30 minutos. Ressuspenda tocando na lateral do tubo. Adicionar solução de PEG para atingir uma concentração final de 12%PEG.
Misture delicadamente invertendo várias vezes. Os protoplastos e a solução de PEG são frágeis, por isso não agite o tubo. Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 10 minutos.
Diluir com cinco volumes de solução de incubação e misturar suavemente por inversão. Centrifugar os tubos a 100 G durante quatro minutos. Lave uma vez com um tampão de incubação de mililitros.
Tenha cuidado para não perturbar o pellet. Gire a 100 G por três minutos. Ressuspender em tampão de incubação até uma concentração de 500 a 1000 células por microlitro.
Incubar no escuro durante a noite à temperatura ambiente. No dia seguinte, gire para baixo a 100 G por quatro minutos. Lave duas vezes com solução de incubação resfriada.
Gire cada vez por três minutos a 100 G à temperatura ambiente. Ressuspenda e, em seguida, carregue uma pequena alíquota no hemocitômetro para a verificação final. Primeiro, conte o número total de protoplastos sob campo claro.
Agora, observe a fração de protoplastos que fluorescem sob UV para verificar a transfecção. Os protoplastos estão expressando nosso repórter GFP. Agora, vamos obter algumas métricas sobre a eficiência da transfecção.
Nessa preparação, obtivemos 10 milhões de protoplastos totais, dos quais transfectamos 1 milhão. No dia seguinte, recuperamos 335 mil. Desses, tivemos uma taxa de transformação de 30,3%, o que nos deixa com nosso total de cerca de 100.000 protoplastos expressando GFP.
A eficiência da transfecção pode variar. Como você pode ver no gráfico, vemos rotineiramente eficiências entre 20 e 50% entre preparações repetidas. Este protocolo permite a coleta e transformação de milhões de protoplastos de mesofilo de milho.
Uma das melhores partes do protocolo é sua capacidade de escalar. Ao dimensionar a quantidade de volume, bem como o número de protoplastos usados na transformação, você pode aumentar sua transformação em mais de uma ordem de magnitude do que mostramos hoje. Até o momento, nosso maior experimento de tubo único começou com 20 milhões de protoplastos e 200 microgramas de DNA, e terminou com 3,1 milhões de protoplastos transformados no dia seguinte.
Esse protocolo de alto rendimento é especialmente útil quando você precisa testar muitas construções de plasmídeos diferentes, mas os colaboradores usaram esse protocolo para fins que não exigem a capacidade de aumentar a escala, como projetar circuitos de genes sintéticos e milho. Obrigado por assistir ao nosso vídeo. Esperamos ter ajudado.
