Sequenciamento total do genoma, mineração de genomas e redes moleculares constitui a base para o guia de espectrometria de massa que o protocolo de mineração de genomas que descrevemos aqui. E são a abordagem mais contemporânea na descoberta de produtos naturais. A mineração de genomas e a rede molecular combinam em cluster, em anotações codificadas em sequenciamento de genomas inteiros com assinaturas de reestruturação química de extratos brutos fornecendo perspectivas maciças para descobrir umbigo por moléculas ativas.
Em princípio, a mineração de genomas tem como alvo um único ou pequeno grupo de moléculas por experimento. Resultando assim em uma taxa de descoberta lenta. Nesse sentido, o uso da mineração de genomas junto com a rede molecular representa um importante avanço para a pesquisa de produtos naturais.
A mineração de espectrometria de massa é um método versátil que pode estruturar informações de vários quimiotipos contidos na grande quantidade de dados de um extrato bruto simultaneamente. Hoje é uma metodologia de alto alcance capaz de explorar a sequência bacteriana, fúngica ou de plantas. Quimótipo ao genótipo e genótipo para quimiotipo bioinformática liga entre aglomerados biossintéticos e são pequenos produtos de moléculas.
Ouvir o protocolo é demonstrado para caracterizar as profundidades do ciclo do umbigo Produtos peptídeos observados em extratos metabólicos de espécies de estreptomoseces. Mas é aplicável à sequência fúngica e plantas e extratos também. É muito importante ter um conjunto de dados de genoma bem curado e hoje em dia sequências fragmentadas de rascunho têm sido cada vez mais suplantadas por dados de sequência quase acabados.
Além disso, diferentes estratégias foram desenvolvidas para acessar novos produtos naturais bioativos e, certamente, combiná-los com a abordagem do GUIA MS. Levaremos à melhoria do isolamento de produtos naturais e à elucidação da estrutura. Como aqui estamos conectando genótipo à abordagem do quimiotipo, as ligações bioinformáticas entre aglomerados biossintéticos e produtos de pequenas moléculas são cruciais.
para estimar a variedade e classe de compostos e codificar por genoma. O que significa a replicação. Posteriormente, o cluster com base em similaridades de íons pode ser pré-formado usando GNPS.
Demonstrando o procedimento estarão a Dra Renata Sigrist e a professora Angolini, minhas colaboradoras neste estudo. Para obter em silico informações sobre agrupamentos genéticos de metabolismo secundário anotações de um genoma sequencial completo. Envie o arquivo de sequência, o banco genético E-M-B-L ou o formato mais rápido, para uma plataforma anti-esmagamento.
Assim como os aglomerados genéticos de interesse dos dados de saída com base no cluster mais semelhante conhecido. Com base nas informações de sequência de DNA do BGC, projeta primárias entre 20 a 25 nucleotídeos flanqueando o aglomerado genético para estreptomosecos ecológicos. Triagem da biblioteca de cromossomos artificiais.
Após a obtenção do organismo heterologo recombinante de acordo com o manuscrito, inocular um décimo 100º da precultura das cepas em meios de fermentação apropriados. Como mídia ISP2 líquida. Coloque a cultura em uma incubadora a 30 graus Celsius e 220 RPM, durante sete dias.
Após a inoculação, centrifugar as culturas a 2200 vezes G por 10 minutos. Descarte as células e transfira o sobrenante para um funil separador. Adicione um a um volume de acetato etílico e agite.
Aguarde de um a três minutos para que as camadas orgânicas e aquiescadas separem. E coletar a camada orgânica em um frasco de Erlenmeyer. Para adquirir dados MS/MS.
Programe métodos adequados de espectrometria hplc e de massa usando o software de controle. Nota-se que a rede MS/MS é a rede molecular detectável sob as condições espectrométricas de massa. Converta espectros de massa para o formato mzXML usando MS Convert do assistente protea.
Ajuste os parâmetros de entrada para a conversão. Carregue os arquivos LC-MS/MS convertidos no banco de dados GNPS. Duas opções estão disponíveis.
Usando um protocolo de transferência de arquivos ou diretamente em um navegador através da plataforma online. Depois de criar uma conta no GNPS, faça login na conta criada e selecione criar uma rede molecular. Adicione um título de trabalho.
Para executar opções básicas. Selecione os arquivos mzXML para executar a rede molecular. Organize-os em até seis grupos.
Assim como as bibliotecas para a rotina de desreplicação. Selecione a tolerância de massa de íon precursor e fragmento Da na tolerância em massa de 0,02 Dalton e 0,05 Dalton, respectivamente. Para executar opções avançadas de rede, selecione os parâmetros que influenciaram diretamente o tamanho e a forma do cluster de rede.
Parâmetros avançados estão na documentação do GNPS. Escolha um endereço de e-mail para receber um alerta quando o trabalho estiver feito e envie o trabalho. Para analisar os resultados do GNPS.
Faça login no GNPS. Selecione trabalhos, trabalhos publicados, feitos para abrir um trabalho. Uma página web é aberta com todos os resultados obtidos a partir de redes moleculares exibidas.
Selecione exibir famílias espectrais no visualizador de rede do navegador para ver todos os clusters de rede. Uma lista é exibida com todos os clusters de rede molecular gerados. A identificação molecular provisória é exibida em todas as identidades.
Selecione o show para visualizá-los. Para analisar o cluster de rede molecular, selecione visualizar a rede. Na caixa de rótulos de nó, selecione a massa dos pais.
Na caixa de etiquetas de borda, selecione co-signo ou Delta Emz. Observar a semelhança do nó ou a diferença de massa entre nós, respectivamente. No caso de análise multipartidária, clique em desenhar tortas na caixa de coloração do nó.
Observar a frequência em que cada nó aparece em cada grupo. Para ver todas as bibliotecas, selecione a exibição, toda a biblioteca, hits. Abra o espectro de fragmentação diretamente na plataforma GNPS.
Ou em arquivos brutos originais para confirmar manualmente compostos de dereplicação e elucidação de estrutura de compostos relacionados. O protocolo foi exemplificado com sucesso usando uma combinação de mineração de genoma, expressão heteróloga e abordagens de código guiadas por MS. Para acessar novas moléculas especializadas de Valinomicina e analógicas.
O fluxo de trabalho do genoma para molécula para a valinomicina alvo é apresentado aqui. O cromatógrama mostrou que valinomicina, montanastatina e cinco análogos foram produzidos por valinomicina, expressão de aglomerados genéticos biossintéticos em um hospedeiro heterólogo. Íons de rede molecular correspondentes à valinomicina, um composto já conhecido com os aglomerados genéticos biossintéticos correspondentes anotados em espécies de estreptomices, CBM AI dois zero quatro dois genomas.
São agrupados com íons relacionados a análogos, primeiro descritos para o aglomerado genético biossintético valinomicina. Os espectros de MS e estruturas químicas para valinomicina e análogos relacionados, são mostrados aqui. Realizar o sequenciamento de genomas inteiros e a curadoria adequada do conjunto de dados é o primeiro passo para eleger um cluster biossintético para a mineração do genoma.
Todo o procedimento pode ser realizado com os tipos selvagens de extrato bruto de corda, mas você pode optar por selecionar o aglomerado genético de seu interesse e promover a expressão heteróloga. Diferentes métodos são descritos para capturar todo o aglomerado genético biossintético de uma amostra de DNA. A maior vantagem deste protocolo é sua capacidade de replicar rapidamente perfis metabólicos e criar informações genômicas com dados de ESM.
A fim de elucidar estes como de novas moléculas. E a mineração de genoma-guia em massa foi descrita pela primeira vez no campo da genômica de peptídeos e glicogenômicas por Doris Chime e colegas. E após a introdução da metabolômica integrada NPS e da abordagem de mineração de genomas tornaram-se a via mais versátil para conectar redes moleculares com capacidades biossintéticas.
