A pesquisa biomédica enfrenta uma crise de reprodutibilidade na forma de que novos achados de pesquisa raramente são traduzidos em aplicações terapêuticas. Este protocolo reduz o fator humano e introduz automação e padronização na fabricação. Este método se concentra especificamente em hidrogéis foto-transfronteiriços para aplicações de cultura celular 3D, pois os hidrogéis tornaram-se a plataforma mais usada em câncer e outros modelos de tecido de doenças na última década.
Abordamos com sucesso as atuais limitações de hardware e software com o desenvolvimento de uma plataforma de tecnologia de código aberto. Esta plataforma foi especificamente projetada para hidrogéis e permite fluxos de trabalho de fabricação automatizados para pesquisa de engenharia de tecidos. Para instalar a API, abra a interface da linha de comando.
Para instalar a API de trabalho, digite pip instale estação de trabalho aberta e pressione Enter. Para operar o módulo de bio fabricação de tubulação, digite o comando para instalar a API opentrons. Em seguida, use a linha de comando para abrir um script Python e verificar se ambas as APIs foram instaladas com sucesso.
Para gerar o código de protocolo, abra o aplicativo de design de protocolo para gerar um script de protocolo personalizado que será executado pela plataforma. A interface é executada em todos os navegadores de internet comumente usados. Digite o nome do protocolo na página de configuração e clique em Continuar.
Na configuração da bandeja de entrada, selecione três por quatro blocos de aquecimento para definir a bandeja de entrada. Para definir os materiais e concentrações de estoque, selecione Gel 1 no menu de entradas definidas e digite GelMA como o nome. Defina a concentração de estoque para 20% e o número de amostras para três e clique em Adicionar para salvar as entradas e preencher a primeira coluna.
Selecione Gel 2 no menu de entradas definir e digite Alginate como o nome. Defina a concentração de estoque para 4% e o número de amostras para três e clique em Adicionar para salvar as entradas e preencher a segunda coluna. Depois de definir os parâmetros fotoiniciais e diluidores como demonstrado, selecione o crosslinking de fotos, defina o tempo para 30 segundos e a intensidade para dois e clique em OK. Em seguida, defina o tipo de placa de poço para placa de 96 poços e clique no Grupo 1 para permitir que os parâmetros para a criação de hidrogéis de rede dupla sejam especificados.
Em seguida, verifique a caixa de protocolo de mistura avançada, se necessário, defina o número de amostras para 96 e clique em Continuar. Para definir o layout do deck, selecione o tipo de bandeja apropriado para cada slot. Quando todos os tipos de bandeja tiverem sido selecionados, clique na caixa esquerda da pipeta e selecione deslocamento positivo de 10 a 100 microliter do menu suspenso.
Coloque a velocidade de aspiração em 600 e a velocidade de distribuição para 800. Em seguida, coloque os parâmetros certos da pipeta da mesma maneira. Em seguida, clique em Gerar Protocolo para gerar e salvar o script do protocolo.
Antes de executar o protocolo, pulverize os consumíveis com 70% de etanol e posicione-os de acordo com a configuração definida na configuração do usuário. Coloque os tubos de reação com os materiais no bloco de alumínio nas docas de temperatura de acordo com a configuração selecionada. Em seguida, pulverize suas luvas com 70% de etanol e abra os tubos de reação cuidadosamente sem tocar nos tubos abertos.
Quando as substâncias atingirem a temperatura experimental apropriada, execute o protocolo gerado usando a interface do usuário. A estação de trabalho começará com o processo de guinadas, seguida por obter uma placa de poço vazia do módulo de armazenamento. Depois de remover a tampa da placa do poço, a placa é transportada para o próximo módulo.
O protocolo especifica o volume que está sendo pipetado de cada solução de estoque e altera automaticamente as pontas após cada material para evitar contaminação cruzada. Para misturar soluções viscosas de forma reprodutível, a estação de trabalho executa um protocolo de mixagem específico que foi otimizado para hidrogéis viscosos. O aplicativo de design de protocolo leva em conta o nível de enchimento do reservatório e adapta automaticamente a altura de mistura para evitar mergulhos desnecessários nos materiais viscosos.
Após geração automática de modelos 3D e placas de poço, a estação de trabalho fecha a placa do poço com a tampa novamente e armazena a placa de poço na posição programada no módulo de armazenamento. Uma vez terminado o protocolo, remova a placa do módulo de armazenamento. Para validação e verificação do protocolo conduzido, carregue a placa em um espectotômetro e leia a absorvência duas vezes a 450 nanômetros.
Após salvar os valores de absorção, abra o arquivo da planilha de análise que é fornecido como material complementar na publicação e copie as leituras de absorvência na tabela na folha de dados bruta. Em seguida, clique na folha de análise para visualizar os valores médios, o desvio padrão e o coeficiente de valores de variância, que são automaticamente calculados e exibidos para uma distribuição uniforme de amostra para linhas específicas e para colunas específicas de uma placa de poço 96. Para encontrar a configuração que garante uma alta reprodutibilidade para soluções de glicerol, foram gerados protocolos sem controle de temperatura e sem toque de ponta, com controle de temperatura e sem toque de ponta, ou com controle de temperatura e com toque de ponta.
O coeficiente calculado de valores de variação para as três configurações revelou uma influência significativa da doca de temperatura e da função de toque de ponta, destacando a capacidade do protocolo de gerar resultados altamente reprodutíveis quando utilizado ambos os recursos. Utilizando a função de toque de ponta com a doca de temperatura, o desvio padrão foi significativamente reduzido na configuração três. A plotagem dos valores de absorção da amostra para a configuração três não produziu valores crescentes ou decrescentes ao longo do experimento e, portanto, não indicou influência da posição amostral sobre os valores de absorção.
Em seguida, uma série de diluição do GelMA foi preparada diluindo uma solução de estoque de 20% GelMA e avaliando as diferenças entre diferentes diluições de GelMA. O valor de absorção medido a cada etapa de concentração foi significativamente diferente e a regressão linear demonstrou um alto ajuste confirmando a capacidade de etapas de concentração distintas a serem geradas. Além disso, a influência do toque de ponta foi avaliada para hidrogéis de rede dupla com 5%GelMA, 2%alginate e 0,15%LAP, que foram gerados automaticamente com a configuração.
A integração do toque de ponta resulta em uma diminuição significativa do desvio padrão que suporta a geração de um conjunto de dados reprodutível. A visualização dos valores de absorção e mapas de calor confirmou o desvio reduzido ao usar o toque de ponta para remover o excesso de material da ponta. Nossa tecnologia permite a automação da fabricação de hidrogel para cultura celular 3D e engenharia de tecidos.
É uma solução de baixo custo para aumentar o throughput e a reprodutibilidade de fluxos de trabalho tecnicamente desafiadores. Ao fornecer uma abordagem de código aberto personalizável, essa tecnologia abre caminho para a adaptação generalizada da automação de processos em pesquisas de engenharia de tecidos.
