Lesões de globo aberta podem levar à perda permanente de visão se não tratadas. Este modelo de cultura de órgãos do segmento anterior permite a avaliação dessas lesões dentro da necessidade de testes em animais. Este protocolo permite rastrear lesões de globo aberto, e terapêutica, para estabilizar a lesão por três ou mais dias com uma plataforma de cultura de órgãos.
Demonstrando o procedimento estará Trent Pearson, um técnico de pesquisa do laboratório Dr. Boice. Para começar, coloque a cortina cirúrgica e os instrumentos necessários para a dissecção bruta. Configure o armário de bio segurança para visualizar os olhos no microscópio dissecando.
Configure o armário de bio segurança para montagem de pratos. Configure o espaço de trabalho de indução de danos abertos do globo dentro do armário de bio segurança. Posicione o vício de rastreamento cruzado na tomada de laboratório, em frente à plataforma de perfuração.
Depois de remover os tecidos orbitais extras e lavar os olhos com antibiótico antimíctico PBS, para hemisect o olho colocar o olho na gaze antimíctica antibiótico PBS encharcada. Use um razorblade ou bisturi estéril para criar uma incisão perto do equador do olho. Em seguida, hemisect o olho usando tesoura cirúrgica curva para isolar o olho anterior.
Use micro tesoura como pá para colher o humor vítreo do segmento anterior e remover a lente do segmento anterior com micro tesoura. Corte gradualmente a íris para a raiz da íris radialmente até que a malha trabecular seja visível. Estenda o corte de 360 graus ao redor da íris, para expor toda a região de malha trabecular e limpar qualquer íris residual restante cobrindo a malha trabecular, se necessário.
Corte os restos do corpo ciliar posteriormente à região de malha trabecular deixando apenas uma faixa fina de um milímetro do tecido. Depois de colocar o segmento anterior na placa de Petri. Molhe um cotonete na mídia e gentilmente dab no centro da córnea para remover qualquer pigmento.
Segure os olhos com fórceps e remova pigmento extra ao redor da esclera limpando. Coloque o segmento anterior invertido sobre a região elevada do prato inferior, garantindo que a córnea permaneça no centro da região elevada. Posicione o anel de fixação na parte superior do segmento anterior recém-colocado e aperte suavemente os parafusos com a tecla L.
Conecte os conectores fluidos com anéis O em portas roscadas na parte inferior do prato. Ao primeiro conector fluido, conecte-se 18 medidor de 90 graus de eixo de agulha dobrada, um comprimento de tubulação, um hub de agulha de 18 medidores, um filtro de seringa de nylon, uma válvula de três vias e uma seringa de 20 milímetros cheia de mídia. Para o segundo conector fluido anexar 18 medidor de 90 graus de eixo de agulha dobrada, um comprimento de tubo, um hub de agulha de calibre 18, uma válvula de três vias como demonstrado para o primeiro conector de fluido e, em seguida, anexar a porção do barril de uma seringa estéril de 10 mililitros, que atuará como um reservatório para capturar o líquido e bolhas.
Mantendo as válvulas de três vias abertas adequadamente às seringas, empurre suavemente a mídia através do sistema, usando a primeira porta do conector fluido. Para inflar o segmento anterior, encha a tubulação com mídia e, eventualmente, encha o reservatório. Remova as bolhas empurrando suavemente a mídia para dentro do prato e inverta o prato para empurrar as bolhas.
Coloque o prato de cultura de órgãos do segmento anterior na incubadora de cultura celular. Direcione as linhas de tubulação pela parte inferior da porta da incubadora para evitar interferências na abertura e fechamento da porta. Posicione as linhas de tubulação com o reservatório no instrumento transdutor de pressão.
Conecte a válvula lateral de três vias ao transdutor de pressão configurado enquanto o PBS flui através da linha para evitar que as bolhas de ar entrem nas linhas de tubulação. Dentro do gabinete de segurança biológica preparado para a indução de lesão aberta, o regulador de pressão na plataforma de punção a 50 libras de força por polegada quadrada para gerar força de perfuração adequada nos objetos de até 4,5 milímetros de diâmetro. Posicione o vício de rastreamento cruzado na tomada de laboratório em frente à plataforma de perfuração.
Estenda o braço do pistão até sua distância máxima e posicione o ápice da córnea dentro da região de um milímetro do objeto de puncção, retraia o braço do pistão e aproxima o segmento anterior um centímetro mais próximo do objeto de puncção. Para disparar o dispositivo de punção, ligue o dispositivo e abra a válvula solenoide com o segundo interruptor no dispositivo. Para retirar o dispositivo do olho, pressione o segundo interruptor, verifique a indução adequada da lesão por inspeção visual e vazamento de mídia do local da lesão.
Após a cirurgia, a integridade do epitélio córnea foi avaliada por meio de imagem utilizando tomografia de coerência óptica. O tecido do segmento anterior ferido foi retratado imediatamente após lesão e 72 horas após a lesão. Os olhos controlados não mostram nenhuma interrupção perceptível na córnea enquanto ferimentos claros foram localizados através da córnea após o ferimento.
A partir da projeção de intensidade máxima de cima para baixo, era evidente que as lesões eram irregulares em forma e tamanho, mas o tamanho da lesão foi diminuído ao longo de 72 horas. A pressão interocular foi observada nos três primeiros dias antes da cirurgia para determinar a estabilidade da pressão na faixa aceitável. Nos resultados representativos, três de cinco olhos caem dentro da faixa de pressão interocular aceitável.
A pressão interocular muda devido à lesão do globo aberto e intervenção terapêutica. Após a indução da lesão do globo aberto, a pressão diminuiu significativamente e permaneceu baixa até que o experimento estivesse completo. O tratamento dos tecidos lesados com adesivo dermabond resultou em uma pressão interocular aumentada em comparação com o tecido não tratado, o que indica que este método pode ser usado para medir a eficácia da terapêutica para restaurar a pressão intraocular.
A configuração inicial do segmento na cultura dos órgãos é fundamental para a estabilidade a longo prazo do tecido. Apertar o anel pode causar estresse no tecido e reduzir a conformidade.
