Este protocolo de encapsulamento de oócitos suínos permite manter a organização esférica dos COCs. Isso evita seu achatamento e consequente interrupção das junções de lacunas entre o oócito e as células foliculares circundantes. As principais vantagens dos dois protocolos descritos são que são fáceis de usar e permitem o controle efetivo tanto da sobrevivência das células oócitos quanto da quimio.
Ambos os sistemas culturais são ferramentas valiosas para pesquisas básicas em biologia reprodutiva, e podem ter relevância clínica para um melhor tratamento de infertilidade. Também podem ser aplicados para o desenvolvimento de novos métodos de biotecnologia e para melhoria da pecuária. Depois de enxaguar os ovários, transfira-os para um béquer cheio de hm médio e armazene-os em uma incubadora a 38 graus Celsius durante todas as manipulações subsequentes.
Aspire o fluido folicular de grandes folículos suínos e centrífuga-o a 100 vezes G por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, filtre o supernascer usando uma seringa estéril presa a um filtro de poros de membrana de 0,2 micrômetro, e esma o congele a 80 graus Celsius negativos. Para isolar os COCs de folículos de médio porte, transfira de dois a três ovários para uma placa de Petri estéril de 10 centímetros cheia de HM. Corte suavemente a superfície dos folículos ovarianos salientes com uma lâmina cirúrgica estéril número 15, o que fará com que o fluido folicular e os COCs fluam para a placa de Petri.
Aspire o conteúdo folicular com uma agulha de calibre 28 presa a uma seringa descartável, e transfira-o para outra placa de Petri. Para preparar as placas de Petri de FIV, adicione um mililitro de HM aos poços centrais, e coloque de três a quatro gotas de HM nos anéis externos. Em seguida, use uma micropipette de policarbonato para mover os COCs não danificados para gotas de HM nos anéis externos, e enxágüe-os brevemente três a quatro vezes.
Quando terminar, transfira-os individualmente para o poço central. Armazene as placas de FERTILIZAÇÃO IN VITRO na incubadora. Prepare soluções de trombina e fibrinogênio, conforme descrito no manuscrito do texto.
No dia do procedimento, descongele lentamente a solução de fibrinogênio no gelo, e leve-a à temperatura ambiente logo antes do uso. Misture 0,5% de solução de alginato e a solução fibrinogênio em uma proporção de um para um para um volume final de dois mililitros e suavemente vórtice da mistura. Reparar câmaras de incubação aplicando tiras finas de filme de parafina em lâminas de microscópio de vidro.
Pipeta 7,5 gotas de microliter da mistura FA no slide de vidro revestido de filme de parafina com espaçadores separados, colocando de oito a 10 gotas dispostas em duas linhas. Use uma micropipette para transferir de três a cinco COCs para o centro da queda da FA, juntamente com um volume mínimo de meio de maturação. Adicione 7,5 microliters de solução de trombina em cima de cada gota de FA para cobri-la.
Não há necessidade de misturá-los porque o gel se forma quase instantaneamente. Cubra a câmara de incubação com um slide de vidro previamente preparado, em seguida, vire a câmara de cabeça para baixo e coloque-a em uma placa de Petri de 100 milímetros forrada com papel filtro úmido. Coloque a placa de Petri na incubadora de 5% de dióxido de carbono a 38 graus Celsius por cinco a sete minutos.
Após a incubação, transfira cada cápsula FA para um poço de uma placa de 96 poços contendo 100 microliters de meio de maturação. A cada dois dias, substitua metade do meio por meio de maturação pré-equilibrado fresco. O COC de imagem está usando um microscópio de luz invertida a 10x de ampliação.
Depois de esculpir os COCs por quatro dias, remova o meio de maturação dos poços e adicione 100 microliters de 10 unidades internacionais por mililitro algenate lysate em DMEM. Deixe a placa de cultura na incubadora por 25 a 30 minutos. Remova os COCs das cápsulas dissolvidas.
Lave-os no DMEM várias vezes e transfira-os para o anel interno de um prato de FIV contendo PBS. Faça uma cama de cinco gramas de pó FEP em uma placa de Petri de 30 milímetros. Distribua uma única gota de meio de maturação contendo três a cinco COCs no pó FEP.
Gire a placa suavemente em um movimento circular para garantir que as partículas cubram completamente a superfície da gota líquida e formem mármores líquidos, ou LMs. Prepare vários pratos de Petri de FERTILIZAÇÃO INVI, de 60 milímetros, e adicione três a quatro mililitros de água estéril aos anéis externos para criar uma câmara de umidade. Pegue o LM formado com uma pipeta de 1000 microliter e coloque-a no poço central.
Incubar as bolinhas de gude por quatro dias a 38 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%. Para alterar o meio, aplique 30 microliters de meio de maturação em cada LM, o que fará com que se espalhe. Quando o conteúdo de mármore se dissolver, transfira os COCs liberados do bio-reator para uma gota de meio de maturação fresco na placa de Petri.
Após três a quatro lavagens em meio de maturação, transfira os COCs, juntamente com 30 microliters de meio fresco, para o leito de pó fep. Gire suavemente a placa em um movimento circular para garantir que as partículas de pó cobrem completamente a superfície da gota líquida e formem um novo LM.Em seguida, transfira o LM para a placa de Petri de FERTILIZAÇÃO IN VITRO. Ambos os sistemas de maturação in vitro produziram COCs com células de granulose que foram fortemente aderidas umas às outras e camadas intactas de células cumulus.
A análise de viabilidade do COC confirmou que as condições ideais de crescimento foram alcançadas em ambos os sistemas de encapsulamento. Em ambos os grupos, apenas locais de oócitos de alta viabilidade foram observados. Os oócitos foram imagens com microscopia eletrônica de transmissão.
As mitocôndrias foram distribuídas uniformemente e tinham uma forma semelhante a uma concha. Apenas alguns deles foram alongados e seu agrupamento foi esporadicamente observado. O ânticulo endoplasmático foi associado com mitocôndrias ou livre no citoplasma oócito.
Gotículas líquidas apareceram como pequenas estruturas escuras, redondas e os aparelhos Golgi surgiram com cisternae dilatada. É importante ser preciso e cuidadoso ao transferir cápsulas fa da câmara de incubação para placas de cultura e ao pegar e transferir o formato LM para a placa de Petri de FIV.
