Este trabalho foi financiado pelo NIH (U54HD41857 e PL1EB008542, um Núcleo de Biomateriais P30 dentro do Consórcio Oncofertility Roteiro de subvenção).

1. Isolamento folículo Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e Uso Animal, instituído Institucional e protocolo de atendimento na Northwestern University. Para melhores resultados, todas as dissecções são realizadas em L15 de mídia para o controle de pH a níveis ambientais de CO 2, em 37 ° C estágios aquecida para controle de temperatura, e em uma bancada limpa para minimizar a contaminação bacteriana. A mídia dissecção (DM) é preparado com L15 meio suplementado com 50 UI / mL de penicilina e estreptomicina 50 mL / mL e 1% de SFB. Os meios de comunicação de manutenção (MM) é preparado com a mídia αMEM suplementado com 50 UI / mL de penicilina e estreptomicina 50 mL / mL e 1% de SFB. <ol><li> Transferência de ovários recém-dissecado de 16 dias mouse antigo em um prato de 35 milímetros nova Petri com 1-2 MM mL contendo 0,1% de colagenase e DNase 0,1%. Incubar por 15 minutos dentro de uma incubadora a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Após a incubação, realizar várias etapas de lavagem no DM para remover colagenase, e depois transferir para uma placa de Petri 35 mm com DM fresco. Isolar folículos do ovário suavemente flicking (ou corte) longe de folículos do ovário inteiro usando duas agulhas calibre 28 08/05 anexado a seringas descartáveis. Remover o estroma tanto quanto possível, sem prejudicar a integridade do folículo. Dissecar 20-40 folículos secundários por ovário (130-150mm). Estes folículos geralmente têm 2-3 camadas de células somáticas. </li><li> Adicionar 1 mL MM para o poço central de uma 60 milímetros FIV (fertilização in vitro) placa de Petri, e 3 MM mL para o anel externo. Transferência de folículos intacto com uma pipeta para o anel externo do prato FIV brevemente enxágüe, em seguida, seletivamente transferi-los para o bem central (Ver 1.4). Armazenar este prato FIV na incubadora. </li><li> Depois de todos os folículos são coletados, a etapa de seleção é realizada sob um microscópio de dissecação com uma ampliação de 5 8x. Folículos saudáveis ​​têm as seguintes características morfológicas: <ul><li> 2-3 camadas de células somáticas </li><li> 130-150 milímetros </li><li> Há separação entre oócito e células somáticas </li><li> Oócitos intactos e redondo Transferir os folículos saudáveis ​​para o centro dos pratos de fertilização in vitro para encapsulamento. </li></ul></li></ol> 2. Encapsulation folículo, Método 1 - &quot;O Método Drop&quot; <ol><li> Adicionar 1 mL de 50 UI / ml de trombina em TBS com 40 mM CaCl 2 para o meio do prato bem fertilização in vitro. Descongelar e manter estoque de fibrinogênio (50 mg / mL em TBS) no gelo. Trazer o fibrinogênio direito à temperatura ambiente antes de usar. </li><li> Prepare a solução de fibrinogênio / alginato, misturando 1x PBS, alginato de 0,5% em solução de PBS e 50 mg / mL solução de fibrinogênio na proporção 02:01:01 em um tubo de microcentrífuga 1,7 mL estéril. Evitar a introdução de bolhas na solução. Suavemente vórtice e spin-down. A solução parece um pouco nublado e deve ser preparada imediatamente antes do uso. </li><li> Coloque duas gotas de fibrinogênio / solução de alginato no anel externo de um prato de fertilização in vitro: uma gota de 90 mL de encapsulamento e uma gota de 10 mL para a lavagem. Para diminuir a evaporação, desligue o estágio de aquecimento no microscópio de dissecação. Transferência 10-15 folículos para a gota de 10 L com um mínimo de meios de cultura (&lt;5 mL), utilizando uma micropipeta ponta 200 mM, e rapidamente mix. Transferência de todos os folículos para a gota de 90 mL com uma quantidade mínima de solução (&lt;5 mL) a partir da primeira gota, e misturar. </li><li> Ao mesmo tempo aspirar um folículo e 5 mL de fibrinogênio / alginato solução usando a 10 mL ponta da pipeta, ea liberação para a solução de trombina + / Ca 2 no prato fertilização in vitro. Repita este passo até que todos os folículos são encapsulados. </li><li> Cross-link as contas por 5-7 minutos na solução de trombina + / Ca 2. As contas vão ficar mais escura como géis de fibrina. Transferir as contas em uma placa de Petri contendo MM, começando com as contas mais escura primeiro. Incubar o prato por 15-30 minutos inthe incubadora para enxaguar a trombina restantes. </li><li> Transferir as contas em uma placa de cultura de 96 poços contendo 100 mL de meio de crescimento do folículo, ea imagem imediatamente. O meio de crescimento (GM) está preparada com uma mídia αMEM suplementado com 10 mIU / mL de FSH recombinante, 3 mg / mL de BSA, 1 mg / mL de bovinos fetuína, 5 mg / mL de insulina, 5 mg / mL de transferrina, e 5 ng / mL de selênio. </li></ol> 3. Encapsulation folículo, Método 2 - &quot;O Método Parafilm&quot; <ol><li> Prepare a solução de fibrinogênio / alginato, misturando solução de alginato de 0,5% e 50 mg / mL solução de fibrinogênio em uma proporção de 1:1 em um tubo de microcentrífuga 1,7 mL estéril. </li><li> Pipetar 7,5 mL gotas da mistura de fibrinogênio / alginato em uma lâmina de vidro revestidas com parafilme três espaçadores mm. Transferência de um folículo em cada gota, com uma mínimosl quantidade de meios de comunicação. </li><li> Adicionar 7,5 mL de trombina / Ca 2 + solução de cada gota. Mistura é desnecessário porque o gel formas quase que instantaneamente. </li><li> Cobrir o gel com a segunda lâmina de vidro revestido parafilme, coloque as lâminas de cabeça para baixo em um prato de 100 milímetros Petri, e transferir para a incubadora por 5 minutos. </li><li> Transferir as contas em uma placa de Petri contendo MM, e depois para a cultura assim como descrito anteriormente. Se as contas ficar juntos, o que é devido ao cross-linking entre as contas, elas podem ser separadas gentilmente com uma pinça. </li></ol> 4. Imagem do folículo e Mudança de Mídia <ol><li> A cada 2 dias, os folículos cultivados são gravadas usando um microscópio de luz eo diâmetro do folículo é medido com o software programa ImageJ. </li><li> A cada 2 dias, metade dos meios de crescimento (50 mL) é substituído pelo novo, a mídia pré-equilibrada de crescimento. </li></ol> 5. Recuperação do folículo da Matrix 3D e in vitro maturação de oócitos (IVM) <ol><li> Após 8 dias de cultura, os hidrogéis aspecto límpido, devido à completa degradação do componente de fibrina, e os folículos expandir-se para um diâmetro de 300-400 mM. O alginato restante é degradado por alginato-liase, uma enzima de origem vegetal que degrada especificamente alginato e não afeta as células animais. </li><li> Remova a mídia de crescimento de poços contendo as contas e adicionar 100 mL de 10 IU / mL em alginato liase αMEM. Deixar a placa na incubadora por 25-30 minutos. </li><li> Remover folículos dos grânulos dissolvidos com uma ponta final brusco. Primeira transferência para o anel externo de um prato contendo IVF DM, e depois para o centro de bem, também contendo DM para se lavar. </li><li> Após a lavagem, transferir os folículos para o exterior, e, em seguida, anel interno de um prato de fertilização in vitro contendo meio de maturação. No meio de maturação in vitro (IVM) é composto de αMEM, 10% SFB, 1,5 UI / mL de hCG, e 5 ng / mL do fator de crescimento epidérmico (EGF) </li><li> Transferência para incubadora de CO 2 para 15-16 horas. Examine os folículos para a expansão das células do cumulus. Para remover as células cumulus dos oócitos, adicione a solução de hialuronidase a concentração final de 0,1 mg / mL e incube na incubadora por 2-3 minutos. Use uma ponta micropipeta 75 mm para as células cumulus cisalhamento do oócito pipetando cima e para baixo várias vezes. Determinar estágio de maturação do ovócito sob uma luz ou um microscópio de dissecação. Os estágios possíveis, menos para o mais maduro, são: <ul><li> Degenerados. O oócito é fragmentada em duas ou mais peças. </li><li> Vesícula germinativa (GV) palco. O ovócito não retomar a meiose em resposta à exposição hCG, que é evidente pela presença contínua do núcleo do oócito (GV). </li><li> Rompimento da vesícula germinativa (GVBD). A membrana nuclear está ausente do oócito, mas não há nenhum presente corpo polar. Portanto, o óvulo ainda está em meiose-I. </li><li> Metáfase II de oócitos-presos (MII). Retomada da meiose do oócito, e agora está preso em metáfase II. Um corpo polar deve estar visível em uma luz ou um microscópio de dissecação. O ovócito permanecerá em MII, a menos fertilizados em experimentos posteriores. </li></ul></li></ol> 6. Resultados representativos: Nós descrevemos um método de encapsulamento romance de folículos ovarianos em um FA-IPN para a cultura in vitro (Figura 1). Folículos ovarianos consistem de um oócito rodeado por diversas camadas de células somáticas. Comunicação entre os vários compartimentos celulares é essencial para o desenvolvimento folicular saudável e maturação de oócitos. Encapsulamento folículo em um hidrogel 3D suporta expansão do folículo, mantendo a arquitetura do folículo 9,11,12. Como folículos se desenvolvem, seu volume se expande exponencialmente eo biomaterial encapsular deve permitir que esta expansão sem o desenvolvimento de uma força de inibir a compressão. FA-IPN é uma rede construída com dois materiais naturais, onde a fibrina é proteoliticamente degradáveis ​​pela plasmina ativada pelo folículo e alginato é biologicamente inerte 13 (Figura 2). Durante o crescimento do folículo, degradação da fibrina começa localmente perto do folículo, e continua até que a fibrina é eliminado do hidrogel. O componente alginato não-degradáveis, que permanece intacta durante todo o período da cultura, apoia a estrutura 3D do hidrogel. Folículos foram isolados no estágio secundário de desenvolvimento (150-180 diâmetro mm) e se expandiu para 400 m na fase antral de desenvolvimento no gel FA-IPN. Com estimulação hCG, os folículos cultivados pode sofrer expansão de células cumulus e oócitos pode retomar a meiose e progredir para metáfase II para a fertilização. Estes resultados sugerem que o método de encapsulamento e encapsular o material permitido cultura folículo e maturação de sucesso in vitro (Figura 3). Degradação da fibrina em torno do de encapsulamentofolículos ated começa no primeiro dia da cultura e é completado por dia 6. Aprotinina, um inibidor da plasmina solúvel, pode ser usada para alterar degradação da fibrina e estender gradiente mecânicos no material do encapsulamento (Figura 4). Se folículos são cultivadas com 0,01 TIU / mL aprotinina, a fibrina é degradada mais lento durante os primeiros 4 dias. No entanto, os folículos ainda pode evoluir para o estágio antral e ovócitos continuam a ser competentes para retomar a meiose para metáfase II após a aprotinina é removed.A alta concentração de aprotinina (0,1 TIU / mL) inibe significativamente a degradação da fibrina, a rigidez da matriz impede a expansão do folículo e de células somáticas invasão na matriz é observado. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Fluxograma do desenvolvimento folicular. O folículo ovariano é constituído por um oócito localização central rodeado por uma ou mais camadas de células somáticas, que apoiem o desenvolvimento do oócito. Como folículos se desenvolvem a partir secundário para o estágio pré-ovulatório antral, as células somáticas em torno do oócito proliferam e se diferenciam, e do oócito aumenta de tamanho. Maturação in vitro (IVM) é o passo final para a cultura do folículo, quando as células somáticas adjacentes ao oócitos, denominadas células cumulus, expanda após a estimulação hCG, eo ovócito retoma a meiose e progride para uma metáfase II (MII) palco. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2a.jpg" alt="Figura 2a" /> Figura 2a. Alginato e alginato de fibrina para a cultura do folículo 3D in vitro. (A) alginato é um biomaterial natural que é adequado para a cultura in vitro folículo devido à sua gelificação gentil e características bioquímicas, tais como o tamanho da malha, a rigidez controlável e inércia biológica. Alginato é um copolímero de polissacarídeo linear de α-L-ácido gulurônico (G) e ácido-mannuronic D-β (M). Áreas com monômeros G repetindo, denominado &quot;G-blocks&quot;, são ligadas para formar um hidrogel na presença de íons de cálcio divalente. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2b.jpg" alt="Figura 2b" /> Figura 2b. (Bi) Small folículos encapsulado experiência força de compressão baixa em alginato no início da cultura. No entanto, como o folículo se expande o volume deslocado no talão está aumentando, o que resulta em maior força de compressão na direção oposta da expansão do folículo (b-ii). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig2c.jpg" alt="Figura 2c" /> Figura 2c. As cadeias de polímeros individuais são completamente enredado na solução de alginato de fibrina-antes do cross-linking. Ambos os componentes da FA-IPN começar a cross-link imediatamente como eles são expostos à mistura de trombina e do cálcio. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3a.jpg" alt="Figura 3a" /> Figura 3a. Fluxograma para o isolamento de folículos e encapsulamento em um FA-IPN. Folículos secundários são isolados a partir de um rato de 16 dias de idade (Ai). Os órgãos reprodutivos são dissecados (A-II), e os folículos isolados são transferidos para um prato com media de manutenção (A-III). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3b.jpg" alt="Figura 3b" /> Figura 3b O método da gota para encapsulamento folículo em solução de alginato de fibrinogênio (B: i-iv).. Duas gotas de solução de alginato de fibrinogênio, a queda de lavagem (10 mL) ea queda de encapsulação (90 mL) são pipetados o prato (Bi). Próximos 3-5 folículos são transferidos para uma gota de lavagem (B-ii). Após a lavagem e remoção de mídia, os folículos são transferidos para a queda de encapsulamento (B-iii). Cada folículo é aspirado com 5 fibrinogênio solução de alginato-mL com uma ponteira de 10 L e, em seguida, expulsos em trombina / cálcio solução (B-iv). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3c.jpg" alt="Figura 3c" /> Figura 3c. O talão ligações cruzadas por 5 minutos. O método de parafilme para encapsulamento folículo em solução de alginato de fibrinogênio (C: i-iii). Fibrinogênio alginato de solução (7,5 mL) é pipetado sobre a lâmina de vidro revestido e parafilme folículos são transferidos individualmente para cada gota após a lavagem (Ci, ii). Trombina solução (7,5 mL) é adicionado a cada gota (C-III). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig3d_e.jpg" alt="Figura 3d-e" /> Figura 3d - e. As gotas são cobertas com um segundo lâmina de vidro revestido e parafilme a FA-IPN é reticulado na incubadora por 5 minutos. (D) Os folículos encapsulados são transferidos para meios de crescimento em uma placa de 96 poços. (E) Uma imagem de um folículo encapsulada na FA-IPN (seta branca). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Degradação da fibrina pela crescente Follicle. Folículos degradar a componente de fibrina do FA-IPN durante o período de cultura, que é demonstrado por um círculo em volta do folículo. Arquitetura 3D do folículo é suportado pelo alginato restantes. No dia 0 (D0) a fibrina ainda está intacta ea matriz em torno do folículo é nublado, depois de um dia na cultura (D1) o anel de clara em torno do folículo aparece (seta branca) e à frente de degradação da fibrina continua a expandir radialmente no dia 2 (D2) e dia 4 (D4) da cultura. <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Imagens do crescimento folicular. Representante imagens crescimento folicular ofsecondary na FA-IPN no dia 0 (A), 4 (B), 6 (C) e 8 (D) da cultura. Depois de oito dias, os folículos antrais foram maturados in vitro, e os oócitos MII estágio resultantes são mostrados (E, o corpo polar é mostrado com a seta preta). <img src="/files/ftp_upload/2695/2695fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Degradação da fibrina foi inibida pela aprotinina. Growing folículos no dia 2, 4, 10 e 12 são mostradas na primeira linha. Aprotinina em concentrações 0,01 TIU / mL (segunda linha) e 0,1 TIU / mL foi adicionada ao meio de cultura nos dias 0, 2 e 4. Só folículo culturas com 0,01 TIU / mL aprotinina fibrina degradada após a remoção da aprotinina e atingiu a fase antral. Folículos cultivados em 0,1 TIU / mL aprotinina não cresceu na FA-IPN. <table border="1"><tbody><tr><td> Abreviatura </td><td> Nome completo </td></tr><tr><td> Incubadora de CO 2 </td><td> 37 ° C incubadora com 5% de CO 2 </td></tr><tr><td> COC </td><td> Cumulus complexo oócito </td></tr><tr><td> 3D </td><td> 3 dimensional </td></tr><tr><td> DM </td><td> Media dissecção </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Fator de crescimento epidérmico </td></tr><tr><td> FA-IPN </td><td> Fibrina alginato de rede interpenetrante </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Soro fetal bovino </td></tr><tr><td> GM </td><td> Meios de crescimento </td></tr><tr><td> GV </td><td> Vesícula germinativa </td></tr><tr><td> hCG </td><td> Gonadotrofina coriônica humana </td></tr><tr><td> ITS </td><td> Insulina Transferrina suplemento de selênio </td></tr><tr><td> Prato de fertilização in vitro </td><td> Centro de bem 60 milímetros in vitro prato fertilização </td></tr><tr><td> MM </td><td> Meios de manutenção </td></tr><tr><td> MII de oócitos estágio </td><td> Metáfase II de oócitos estágio </td></tr><tr><td> rFSH </td><td> Hormônio recombinante Folicular Estimulante </td></tr><tr><td> TBS </td><td> Tris salina tamponada </td></tr><tr><td> TIU </td><td> Unidades de tripsina inibitória </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Abreviações

<ol>
	<li>Cortvrindt, R., Smitz, J., VanSteirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vitro+maturation,+fertilization+and+embryo+development+of+immature+oocytes+from+early+preantral+follicles+from+prepuberal+mice+in+a+simplified+culture+system.">In-vitro maturation, fertilization and embryo development of immature oocytes from early preantral follicles from prepuberal mice in a simplified culture system.</a> Human Reproduction. 11, 2656-2666 (1996).</li><li>Smitz, J., Cortvrindt, R., Hu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+combined+with+recombinant+human+chorionic+gonadotrophin+improves+meiotic+progression+in+mouse+follicle-enclosed+oocyte+culture.">Epidermal growth factor combined with recombinant human chorionic gonadotrophin improves meiotic progression in mouse follicle-enclosed oocyte culture.</a> Human Reproduction. 13, 664-669 (1998).</li><li>Xu, M., Banc, A., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+Follicle+Growth+and+Oocyte+Maturation+by+Culture+in+Alginate+Hydrogel+Following+Cryopreservation+of+the+Ovary+or+Individual+Follicles.">Secondary Follicle Growth and Oocyte Maturation by Culture in Alginate Hydrogel Following Cryopreservation of the Ovary or Individual Follicles.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103, 378-386 (2009).</li><li>Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+achievements+and+future+research+directions+in+ovarian+tissue+culture,+in+vitro+follicle+development+and+transplantation:+implications+for+fertility+preservation.">Current achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle development and transplantation: implications for fertility preservation.</a> Human Reproduction Update. 16, 395-414 (2010).</li><li>Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpenetrating+fibrin-alginate+matrices+for+in+vitro+ovarian+follicle+development.">Interpenetrating fibrin-alginate matrices for in vitro ovarian follicle development.</a> Biomaterials. 30, 5476-5485 (2009).</li><li>West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+properties+of+alginate+hydrogels+and+their+effects+on+in+vitro+follicle+development.">Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development.</a> Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).</li><li>Kreeger, P. K., Fernandes, N. N., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mouse+follicle+development+by+follicle-stimulating+hormone+in+a+three-dimensional+in+vitro+culture+system+is+dependent+on+follicle+stage+and+dose.">Regulation of mouse follicle development by follicle-stimulating hormone in a three-dimensional in vitro culture system is dependent on follicle stage and dose.</a> Biology of Reproduction. 73, 942-950 (2005).</li><li>Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approach+for+the+three-dimensional+culture+of+granulosa+cell-oocyte+complexes.">Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes.</a> Tissue Engineering. 9, 1013-1021 (2003).</li><li>Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+stage-specific+permissive+in+vitro+culture+environment+for+follicle+growth+and+oocyte+development.">Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development.</a> Biology of Reproduction. 75, 916-923 (2006).</li><li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulated+Three-Dimensional+Culture+Supports+Development+of+Nonhuman+Primate+Secondary+Follicles.">Encapsulated Three-Dimensional Culture Supports Development of Nonhuman Primate Secondary Follicles.</a> Biology of Reproduction. 81, 587-594 (2009).</li><li>West, E. R., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+follicle+micro+environment.">Engineering the follicle micro environment.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25, 287-299 (2007).</li><li>Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+follicles+produce+live,+fertile+offspring.">Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring.</a> Tissue Engineering. 12, 2739-2746 (2006).</li><li>Ebisch, I. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+role+of+the+plasminogen+activator+system+and+vascular+endothelial+growth+factor+in+subfertility.">Review of the role of the plasminogen activator system and vascular endothelial growth factor in subfertility.</a> Fertility and Sterility. 90, 2340-2350 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O ovário apresenta método de encapsulamento em um folículo FA-IPN permite folículo cultura em um ambiente 3D in vitro. A FA-IPN é um processo dinâmico, a matriz de células de resposta em que as propriedades mecânicas iniciais são determinados pela combinação de ambos fibrina e alginato. Durante a cultura, o folículo encapsulado ativa proteases que degradam apenas um componente do IPN, a fibrina, que resulta em um gel, diminuindo gradualmente a rigidez que é contribuição apenas pelo alginato reman...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fetuin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>F3385</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen, Gibco</td>
<td>10082-139</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aprotinin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>10236624001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wako</td>
<td>039-00475</td>
<td>40 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A412</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>rFSH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A.F. Parlow, National Hormone and Peptide Program, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>hCG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>CG-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A1603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ITS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I1884-1VL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&alpha;MEM+Gluta MAX</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>32561</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen-Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>30-002-CI</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pierce</td>
<td>28379</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tisseel Fibrin kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>921030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Alginate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FMC BioPolymers</td>
<td>LF200DL</td>
<td>Mw 418kDa</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

a method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3 dimensional system

O folículo ovariano é a unidade funcional do ovário que secreta hormônios sexuais e suporta maturação de oócitos. Em técnicas folículo vitro fornecer uma ferramenta para o desenvolvimento folicular modelo a fim de investigar a biologia básica, e são ainda a ser desenvolvido como uma técnica para preservar a fertilidade do clínica 1-4. Nosso sistema de cultura in vitro emprega hidrogéis, a fim de imitar o ambiente nativo do ovário, mantendo a arquitetura folicular 3D, interações célula-célula e sinalização parácrina que o desenvolvimento folicular direta 5. Anteriormente, os folículos foram cultivados com sucesso em alginato, um polissacarídeo derivado de algas inerte que sofre gelificação com íons de cálcio 6-8. Hidrogéis de alginato formado em uma concentração de 0,25% w / v foram os mais permissiva para a cultura do folículo, e manteve a mais alta competência de desenvolvimento 9. Hidrogéis de alginato não são biodegradáveis, portanto, um aumento nos resultados folículo de diâmetro em uma força de compressão sobre o folículo que podem impactar o crescimento do folículo 10. Nós posteriormente desenvolvido um sistema de cultura baseado numa rede de fibrina alginato-interpenetrantes (FA-IPN), em que uma mistura de alginato de fibrina e são gelled simultaneamente. Esta combinação fornece um ambiente dinâmico mecânica, porque os dois componentes contribuem para a rigidez da matriz, inicialmente, no entanto, proteases secretadas pelo folículo crescente degradação de fibrina na matriz de alginato deixando apenas para prestar apoio. Com o IPN, o conteúdo de alginato pode ser reduzida abaixo de 0,25%, o que não é possível com alginato sozinho 5. Assim, como o folículo se expande, ele vai experimentar uma força de compressão reduzida devido ao teor de sólidos reduzidos. Aqui, descrevemos um método de encapsulamento e um em sistema de cultura in vitro para folículos ovarianos em um FA-IPN. O ambiente dinâmico mecânico imita o ambiente natural em que ovário folículos pequenos residir em um córtex rígido e mover para uma medula mais permissiva à medida que aumentam de tamanho 11. O componente degradável pode ser particularmente crítica para a tradução clínica, a fim de apoiar o maior aumento de 10 6 vezes no volume que os folículos humano normalmente sofrem in vivo.

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A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

Um novo método para encapsulação de ovário folículos em uma rede de fibrina 3D alginato-interpenetrantes é descrito. Este sistema combina suporte estrutural, com a degradação proteolítica para apoiar o desenvolvimento de folículos imaturos para produzir ovócitos maduros. Este método pode ser aplicado a agregados de cultura de células para manter contatos célula-célula sem limitar a expansão.

Um método para Encapsulation ovário folículo e Cultura em um proteoliticamente Degradáveis ​​3 Sistema Dimensional

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.2K visualizações.  Northwestern University. Um novo método para encapsulação de ovário folículos em uma rede de fibrina 3D alginato-interpenetrantes é descrito. Este sistema combina suporte estrutural, com a degradação proteolítica para apoiar o desenvolvimento de folículos imaturos para produzir ovócitos maduros. Este método pode ser aplicado a agregados de cultura de células para manter contatos célula-célula sem limitar a expansão.

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Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotípica Colágeno Ensaio I: Uma Plataforma maleável para Avaliar Comportamento celular em um contexto de 3-Dimensional

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Bioengenharia

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Criando Two-Dimensional Substratos modelado para Confinamento de proteína e celular

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

Cultivo de células progenitoras neurais em um hidrogel Peptide 3-dimensional de auto-montagem

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Um novo método para localizar Repórter fluorescentes Beads perto da superfície de cultivo celular para Tração Microscopia de Força

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Geração de espessura completa tridimensional Pele Equivalente e Automated Ferimento

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as well as substance testing. These models are mostly cultivated in membrane-insert systems, their permeability toward different substances being an essential factor. Typically, applied methods for determination of these parameters usually require large sample sizes (e.g., Franz diffusion cell) or laborious equipment (e.g., fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)). This study presents a method for determining permeability coefficients directly in membrane-insert systems with diameter sizes of 4.26 mm and 12.2 mm (cultivation area). The method was validated with agarose and collagen gels as well as a collagen cell model representing skin models. The permeation processes of substances with different molecular sizes and permeation through different cell models (consisting of collagen gel, fibroblast, and HaCaT) were accurately described.
Moreover, to support the above experimental method, a simulation was established. The simulation fits the experimental data well for substances with small molecular size, up to 14 x 10-10 m Stokes radius (4,000 MW), and is therefore a promising tool to describe the system. Furthermore, the simulation can considerably reduce experimental efforts and is robust enough to be extended or adapted to more complex setups.

A method for determination of permeability in a membrane insert system for multi-well plates and in silico parameter optimization for the calculation of diffusion coefficients using simulation are presented.

Um método para a determinação e simulação da permeabilidade e difusão em um modelo 3D do tecido em uma membrana inserir sistema para placas multi bem

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

Produção de elastina, como proteína hidrogel para encapsulamento e imunocoloração de células em 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

Ácido hialurônico baseado hidrogel para 3-Dimensional cultura de células de Glioblastoma derivado de paciente

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low cell retention and poor survival within the target zone. However, during the in vitro construction process, a solution for maintaining stem cell bioactivity and increasing the cell amount within the cell sheet is urgently needed. Here, this protocol presents a method for constructing a multilayered cell sheet with favorable stem cell bioactivity and optimal operability. Decellularized porcine pericardium (DPP) is prepared by phospholipase A2 (PLA2) decellularization method as the cell sheet scaffold, and rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are isolated and expanded as the seeded cells. The temporary multilayered cell sheet structure is constructed by using RAD16-I peptide hydrogel. Finally, the cell sheet is cultured with a dynamic perfusion system to stabilize the three-dimensional (3D) structure, and the cell sheet could be obtained following a 48-hour culture in vitro. This protocol provides an efficient and feasible method for constructing a multilayered stem cell sheet, and the cell sheet could be developed as a favorable stem cell therapy product in the future.

This article provides an efficient and feasible method for constructing multilayered stem cell sheets with favorable stem cell property.

Construção de uma folha de células-tronco mesenquimais em várias camadas com um sistema de cultura dinâmica 3D

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

Um método para Encapsulation ovário folículo e Cultura em um proteoliticamente Degradáveis ​​3 Sistema Dimensional

Um método para Encapsulation ovário folículo e Cultura em um proteoliticamente Degradáveis 3 Sistema Dimensional