A vitamina C é um indicador do valor nutricional de frutas e hortaliças. Precisamos de um método fácil e confiável para quantificá-lo, especialmente na alface, o vegetal folhoso mais consumido em todo o mundo. Este método previne a degradação da vitamina C, e fornece uma extração aprimorada e uma quantificação rápida e confiável de ácidos ascóbicos e dehidroascóbicos, graças à sua precisão e sensibilidade.
Este método pode ser usado na tecnologia de alimentos para criar rótulos de fatos nutricionais, na medicina para estudar os efeitos alimentares na saúde e na reprodução de plantas, para aumentar o teor de vitamina C em diferentes espécies. Demonstrando o procedimento com Ines Medina Lozano, estarão José Angel Aranjuelo e Arantzazu Castellanos, dois analistas do meu laboratório. Para preparar as amostras da planta, colher pelo menos uma folha externa e uma folha interna por planta e congelar imediatamente as folhas em nitrogênio líquido, antes de colocá-las em armazenamento de menos 80 graus Celsius.
Para liofilizar as amostras de plantas congeladas, coloque os tubos de amostra não tampados nas bandejas dentro da câmara de secador congelante do liofilizador, e programe o liofilizador conforme indicado. Mantenha a temperatura do condensador a menos 80,2 graus Celsius, e a constante de vácuo em 112 Quando o material estiver completamente seco, adicione bolas de aço inoxidável de 10 milímetros de diâmetro às amostras liofilizadas, em tubos de polipropileno de 20 mililitros. E use um Vórtice Multi-Tubo, no momento e intensidade apropriados, para moer as amostras em uma poeira fina.
Para preparar o estoque padrão de ácido ascórbico e soluções de diluição, pesar exatamente 10 miligramas de ácido ascórbico padrão em uma balança de precisão. E a 90 mililitros de fase móvel para a amostra. Use um agitador magnético para dissolver a amostra e use um frasco volumoso para medir com precisão 100 mililitros da solução resultante.
Adicionando água ultrauso adicional, acidificada no pH dois com ácido fórmico, conforme necessário. Em seguida, prepare cinco diluições do estoque, para obter uma curva de calibração. Trabalhando sob baixa intensidade de luz, adicione 50 miligramas de amostra moída liofilizada e cinco mililitros de solvente de extração, a um tubo de centrífugo de polipropileno de 15 mililitros e vórtice da solução por cinco segundos.
Depois de agitar a amostra por 10 minutos em um agitador orbital a 2000 rotações por minuto, transfira o tubo para um banho ultrassônico por 10 minutos, em temperatura ambiente e colete a amostra por centrifugação. Em seguida, coe o supernaente através de um filtro de celulose regenerada de 0,22 mícrons, em um frasco âmbar de cinco mililitros, para extrair os ácidos ascórbicos e dehidroascóbicos no extrato um. Para preparar a diluição para determinar a concentração de ácido ascórbico nas amostras de folhas, adicione 200 microliters de extrato um, e 800 microliters de água ultrapura em um frasco de cromatografia líquida âmbar de dois mililitros, e feche o frasco com um plugue PTFE/silicone.
Para extração total de ácido ascórbico, transfira 200 microlitadores do extrato um, em um frasco de cromatografia líquida âmbar de dois mililitros, e adicione 200 microliters de solução redutora ao frasco. Feche o frasco com um plugue e o vórtice da solução por cinco segundos. Após uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente, protegido da luz, use 200 microliters de ácido sulfúrico molar de 0,4 molar, para parar a reação e estabilizar o ácido ascórbico, a um pH ácido.
Para preparar a diluição para determinar a concentração total de ácido ascórbico nas amostras, adicione 400 microliters de água ultrauso, para extrato total de ácido ascórbico dois. Feche o frasco com um plugue. Pelo menos uma hora antes de iniciar o experimento, confirme que todas as soluções de trabalho foram carregadas no sistema UPLC e ligue os três módulos UPLC.
Quando o processo de calibração interna estiver concluído, abra o software e carregue o programa instrumental. Uma vez que o software é carregado clique em Quaternary Solvent Manager e clique no botão do mouse direito para selecionar o Console de lançamento, para acessar o console de gerenciamento UPLC. Clique em Sistema, Controle e Inicialização, para prosseguir com a preparação e estabilização do instrumento UPLC, e clique em Prime Solventes, QSM, verifique A, B, C, D, Seal Wash e Duração do Prime, maior que cinco minutos, para limpar todas as linhas UPLC, por pelo menos cinco minutos.
Clique em SM, verifique Wash Solvent superior a 45 segundos. Verifique o Solvente de purga e 35 ciclos para limpar e limpar o injetor. Para equilibrar o UPLC às condições do método, verifique Equilibrate ao Método e QSM e defina o fluxo para 0,3 mililitros por minuto.
Solvente A a 2% solvente B a 0%solvente C 98% e solvente D a 0%Ainda em Equilíbrio com Método e SM e definir a amostra para 5 graus Celsius, e a coluna a 30 graus Celsius. Ainda em Equilibre para Método e Outros, selecione Lamp On e clique em Iniciar. Deixe o equipamento estabilizar por pelo menos uma hora.
Para verificar a estabilidade, clique em Iniciar o Sistema de Console e QSM e selecione QSM System Pressure, apenas para verificar a pressão na coluna. Se não houver tendências identificáveis nas mudanças de pressão, e o valor delta for inferior a 10 libras por polegada quadrada de pressão, na tela de início rápido, preencha a matriz com os nomes dos padrões e amostras a serem analisados. Para determinar a concentração de ácido ascórbico nas normas, injete cinco microlitadores de cada diluição no instrumento UPLC e realize a cromatografia, a partir da maioria diluída, até a solução mais concentrada, conforme indicado na tabela.
Para determinar o ácido ascórbico e a concentração total de ácido ascórbico nas amostras de folhas, injete cinco microliters do extrato diluído um e extraia dois, respectivamente, no instrumento UPLC para análise cromatóbica. Para calcular o ácido ascórbico e as concentrações totais de ácido ascórbico, no software clique quickstart, Browse Project, Channels, o nome do padrão ou da amostra e canal PDA um, 245 nanômetros a 1,2 nanômetros. Para abrir o padrão e provar cromatogramas, clique no ponto de partida do cromatograma e arraste-o até o ponto final, para integrar o pico correspondente nos padrões e amostras.
Em seguida, utilize os dados das diluições padrão de ácido ascórbico, para construir uma curva de calibração, para representar os valores de absorção cromatograficamente determinados e interpolar os valores de absorção da amostra, para obter o ácido ascórbico e a concentração total de ácido ascórbico, de acordo com a fórmula. A quantificação de vitamina C nas matrizes de Lactuca requer o desenvolvimento de uma abordagem cromatográfica que possa garantir resultados confiáveis. Aqui, um cromatograma resultante de um protocolo não otimizado apresentando e pico de ácido ascórbico, juntamente com um ombro de mineiro não identificado pode ser observado.
No entanto, após melhorar a extração e as condições cromatográficas, um pico de ácido ascórbico resolvido sem interferências de compostos desconhecidos pode ser alcançado. Além disso, o uso de equipamentos ultravioleta UPLC, em vez de ultravioleta HPLC, reduz o tempo de retenção e de funcionamento. Interferências nos picos de ácido ascórbico, resultam consistentemente na subestimação do teor de vitamina C, devido a uma separação insuficiente durante o processo cromatográfico.
À medida que as áreas de pico sobrepostas são integradas por uma queda vertical no ponto mais profundo entre elas. Além disso, o uso de um protocolo não otimizado impede a extração de qualquer conclusão útil, dos resultados. Como todas as amostras parecem ter um teor de vitamina C semelhante, em qualquer uma de suas formas.
Em contrapartida, o uso do protocolo otimizado permite a detecção de diferenças estatisticamente significativas entre os diferentes tipos de amostras. Certifique-se de coletar várias amostras, preservar as amostras corretamente, minimizar a exposição da amostra a agentes oxidantes e quantificar ambas as formas de vitamina C.O teor total de vitamina C pode ser quantificado não apenas em qualquer espécie de planta, mas também, em qualquer fruta em qualquer fruta e vegetal, ou mesmo alimentos processados com poucas modificações técnicas.
