Gostaríamos de agradecer a Vikram Darbhe e Patrick Franks por sua orientação experimental. Este trabalho é apoiado pelo Programa de Bolsas de Pós-Graduação em Pesquisa da Fundação Nacional de Ciência sob o Grant No. DGE-1324585, bem como NIH R01D084009 e F31AR076920. Quaisquer opiniões, achados e conclusões ou recomendações expressas neste material são dos autores e não refletem necessariamente as opiniões da Fundação Nacional de Ciência ou do NIH.

O Conselho de Revisão Institucional (IRB) da Universidade Northwestern aprovou os procedimentos deste estudo. Todos os participantes inscritos neste trabalho deram consentimento informado antes do início do protocolo detalhado abaixo. NOTA: O sistema de ultrassom específico utilizado neste estudo tinha recursos EFOV-EUA e foi adotado porque pudemos rever detalhes sobre e avaliações de validade para o algoritmo na literatura científica22,26; vários outros sistemas com EFOV-US também existem18,20,30. Foi utilizado um transdutor linear 14L5 (largura de banda de frequência de 5 a 14 MHz). Os músculos retratados neste protocolo são apenas um pequeno subconjunto de músculos para os quais as imagens dos EUA foram capturadas e comprimentos de fascículo medidos (por exemplo, tríceps25, extensor carpi ulnaris23, gastrocnemius medial10, vasto lateralis24, bíceps femoris8,31). Este protocolo destina-se a fornecer ponteiros e descrever as normas necessárias para que possa ser aplicado a músculos além dos dois exemplos que fornecemos.
1. Coleta de imagens EFOV-EUA dos músculos
Preparação
<ol><li>Preparação do sonografista<ol>
<li>Antes de operar o sistema de ultrassom, leia através do manual do sistema para se familiarizar com a segurança do sistema, cuidado para manter o sistema, configuração e controles do sistema, etc. Além disso, revise as instruções do sistema para obter imagens EFOV-US e esteja familiarizado com o método implementado para obter as imagens EFOV-US. NOTA: Diferentes sistemas de ultrassom nomeiam o modo EFOV-US usando terminologia diferente. Por exemplo, no sistema utilizado aqui, o modo EFOV é chamado de "Imagem Panorâmica". Embora os detalhes técnicos do algoritmo implementado em vários sistemas comerciais geralmente sejam propriedade intelectual e, portanto, não estejam disponíveis livremente, a partir de uma revisão superficial, muitos sistemas comerciais com capacidades de ultrassom panorâmico descrevem uma abordagem semelhante à descrita por Weng et al.22. Avaliar a validade geral das medições adquiridas a partir de qualquer sistema, seja obtendo informações mais detalhadas diretamente da empresa que fabrica o sistema, utilizando um fantasma de imagem26,32, ou por outros meios (por exemplo, comparação com a dissecção animal24) é recomendado como um passo importante antes de iniciar a pesquisa envolvendo participantes humanos.</li>
		<li>Tire um tempo para se familiarizar com a anatomia dos músculos de interesse, bem como com a anatomia circundante. Sugere-se que o sonografista use um livro didático de anatomia ou, preferencialmente, um modelo interativo de anatomia 3D on-line para se familiarizar com a anatomia do interesse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação do Participante<ol>
<li>Explique o protocolo do estudo ao participante e adquira o consentimento aprovado pelo IRB antes do início do protocolo de imagem.</li>
		<li>Peça ao participante que use roupas apropriadas para permitir o acesso ao músculo de interesse. Por exemplo, se o sonografista planeja imaginar um músculo do antebraço, o participante deve ser convidado a usar uma camisa de manga curta.</li>
		<li>Coloque o participante em uma cadeira ajustável que pode ser trancada no lugar. Tire um tempo para ajustar a cadeira para deixar o participante o mais confortável possível, enquanto ainda proporciona acesso ao músculo de interesse. NOTA: Se uma cadeira ajustável que pode ficar completamente plana não estiver disponível, alguns desenhos de estudo podem exigir o uso de uma tabela para acessar o músculo de interesse (ou seja, isquiotibiais).</li>
		<li>Coloque a articulação que o músculo de interesse abrange em uma postura que pode ser controlada e repetida. Utilizar orientação clínica33 para localização de marcos anatômicos e implantação de goniometria; usar normas ISB para definir o sistema de coordenadas conjuntas34,35. Em geral, para medir o ângulo articular, marque marcos anatômicos com marcador seguro de pele (Tabela de Materiais) e, em seguida, alinhe o centro de um goniômetro portátil com o eixo de rotação da articulação e os braços do goniômetro até os segmentos articulares. NOTA: Se a imagem do músculo passivo, recomenda-se colocar o músculo de interesse em uma posição relativamente alongada para evitar a imagem do músculo frouxo.<ol>
<li>Para replicar o bíceps brachii conforme imagem deste estudo, participantes do assento com pés apoiados, costas retas, ombro a 85° de abdução e 10° de flexão horizontal, cotovelo a flexão de 25° e antebraço, pulso e dedos neutros.</li>
			<li>Para replicar a tibialis anterior como imagem neste estudo, os participantes do assento com joelho a 60° de flexão e tornozelo a 15° de flexão plantar.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Fixar o membro dos participantes usando alças de pano para minimizar o movimento durante o protocolo de imagem.</li>
	</ol>
</li>
</ol>Aquisição de Imagens
<ol start="3"><li>Ligue e ligue o sistema de ultrassom. Certifique-se de que o exame está definido como Musculoesquelético, o transdutor em uso é selecionado (aqui usamos 14L5), e a frequência de transmissão é definida entre 5-17 MHz (aqui foi utilizado 11MHz), uma faixa de frequência típica para imagens musculoesqueléticos. Frequências mais altas são geralmente usadas para imagens mais superficiais à medida que melhoram a resolução, mas diminuem a penetração de ondas.</li>
	<li>Vá para as configurações do sistema para ajustar as configurações do footswitch. Para efeitos deste protocolo, recomendamos definir o footswitch para iniciar/parar a imagem. Se o footswitch em uso tiver vários pedais, defina pedais adicionais para "Congelar" ou "Pausar", e "Imprimir" ou "Armazenar" a imagem.</li>
	<li>Aplique uma quantidade generosa de gel de ultrassom na cabeça do transdutor.</li>
	<li>Coloque o transdutor na pele do participante na região aproximada de interesse.</li>
	<li>Mova o transdutor no plano de eixo curto do músculo. Observe que o transdutor tem uma pequena protuberância de um lado, chamada de indicador. O lado do transdutor que tem o indicador corresponde ao lado esquerdo da imagem do ultrassom. Ao fotografar no eixo curto, o sonografista mantenha o indicador apontado lateralmente e quando o sonografista estiver em eixo longo, aponte o indicador de forma distral.</li>
	<li>Identifique o músculo de interesse no plano de eixo curto (perpendicular à direção da fibra muscular) e mova o transdutor distal e proximal para obter uma visualização completa do caminho muscular.<ol>
<li>Marque marcos anatômicos importantes (ou seja, as bordas laterais e medial do músculo, a junção do tendão muscular e a inserção muscular) utilizando marcadores de tinta seguros para a pele (Tabela de Materiais).</li>
	</ol></li>
	<li>Uma vez identificado e devidamente marcado a localização do músculo, o sonografista mova o transdutor de ultrassom no plano de eixo longo (paralelo à direção da fibra muscular).</li>
	<li>Começando na extremidade distal ou proximal do músculo, gire e incline o transdutor para identificar o plano fascículo naquele ponto. Faça uma marca na pele quando a posição correta do transdutor tiver sido estabelecida.</li>
	<li>Uma vez que o plano fascicle aproximado tenha sido estabelecido ao longo de todo o comprimento desejado para ser escaneado, tenha a prática de sonografista seguindo esse caminho.</li>
	<li>Para começar a coletar imagens, coloque o sistema de ultrassom no modo EFOV-US.</li>
	<li>A partir de uma extremidade do músculo, clique no footswitch para iniciar a aquisição da imagem e mova lentamente e continuamente o transdutor de ultrassom no eixo longo. Uma vez que o fim do músculo tenha sido alcançado, clique no footswitch para acabar com a aquisição de imagem.</li>
	<li>Pratique e garanta o caminho correto do transdutor. Isso pode tirar várias imagens práticas antes de obter consistentemente imagens EFOV-US de "qualidade" (Ver seção 2 para explicação de imagens de qualidade).</li>
	<li>Para otimizar a visibilidade e clareza da imagem, considere ajustes nos seguintes parâmetros.<ol>
<li>Profundidade: Se a aquisição de imagem terminar antes que o comprimento desejado do músculo possa ser capturado, aumente a profundidade da imagem (no sistema usado aqui, aumentar a profundidade da imagem aumenta o comprimento absoluto que a varredura pode ser).</li>
		<li>Foco: Coloque a seta de foco na metade inferior da Imagem logo abaixo do músculo de interesse.</li>
		<li>Ganho: Certifique-se de que o ganho é equilibrado através da profundidade da imagem.</li>
		<li>Velocidade: Imagem na velocidade ideal como guiada pelo indicador (na maioria dos sistemas um indicador de velocidade exibe no monitor durante a imagem panorâmica).</li>
	</ol></li>
	<li>Uma vez que foram coletadas imagens qualitativamente boas (etapa 2.1), aperte o pedal de footswitch print/store ou um botão sinônimo no painel de controle para salvar a imagem.</li>
	<li>Repetição de passos 1.13-1.16 até 3 imagens EFOV-US de qualidade do músculo são obtidas.</li>
	<li>Repetir as etapas 1.6-1.17 até que todos os músculos de interesse sejam obtidos.</li>
	<li>Use uma toalha para limpar suavemente o gel da pele do participante. Em seguida, o participante enxágue a área da pele ou use uma toalha úmida para limpar a pele que foi exposta ao gel. Seco.</li>
	<li>Limpe gel da cabeça do transdutor e desinfete.</li>
	<li>Exporte imagens como imagens DICOM não compactadas em um CD-DVD, unidade flash ou através da rede local em um computador.</li>
</ol>2. Determinando a "qualidade" da imagem EFOV-EUA
<ol><li>Seguindo a etapa 1.13, que o sonografista identifique e avalie a qualidade das principais características anatômicas do músculo de interesse e sua anatomia circundante. Trata-se de uma avaliação qualitativa baseada no conhecimento do sonografista sobre anatomia e ecogenicidade do tecido musculoesquelético (capacidade de um tecido para refletir ondas ultrassônicas). Para que uma imagem EFOV-US seja considerada qualitativamente "boa" o seguinte deve ser atendido:<ol>
<li>Em qualquer imagem de longo eixo de um músculo, verifique se o sonografista pode identificar claramente o músculo como uma forma hipoecórica (escura) com limites hiperecóicos (brilhantes) que representam a fáscia muscular profunda e superficial.</li>
		<li>Entre os limites musculares, verifique se o sonografista pode identificar o tecido conjuntivo ao redor de um fascículo muscular como linhas hiperecóicas (brilhantes). NOTA: Ao fotografar músculos multi-pennados, a imagem também deve conter tendões centrais que aparecem na barriga muscular, entre a fáscia muscular profunda e superficial, como uma estrutura hiperecóica (brilhante).</li>
		<li>Verifique se a imagem não tem dobra excessiva. Isso geralmente é indicado por sombras ou lacunas na imagem ou uma linha de régua flexível irregular sobre a imagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se faltar uma ou mais das estruturas teciduais descritas no 2.1, considere a imagem "qualitativamente pobre" e volte a viver no modo 2D.</li>
</ol>3. Comprimento do Fascicle Muscular Quanitfying
<ol><li>Para quantificar o comprimento do fascículo muscular, use imageJ, uma plataforma de processamento de imagem de código aberto. ImageJ pode ser baixado em https://imagej.net/Downloads. NOTA: Embora o ImageJ seja frequentemente implementado24,25,31,36,37,38, a quantificação do comprimento do fascicle muscular pode ser medida usando outros softwares de processamento de imagem8,39 ou códigos personalizados40,41.</li>
	<li>Uma vez baixado, abra as imagens de ultrassom como imagens DICOM no ImageJ clicando em Arquivo | Abra e selecione a imagem para analisar.</li>
	<li>Para garantir que as propriedades de imagem DICOM tenham sido preservadas, clique na ferramenta Linha Reta no menu Ferramentas e desenhe uma linha reta de 0 a 1 cm na régua na lateral da imagem do ultrassom. Em seguida, vá para Analisar | Medida para medir a linha feita. Se as propriedades da imagem tiverem sido preservadas, o comprimento da linha reta deve ser de 1 cm.</li>
	<li>Para medir os comprimentos do fascicle na imagem, complete o seguinte.<ol>
<li>Clique com o botão direito do mouse na ferramenta Linha Reta .</li>
		<li>Selecione Linha Segmentada.</li>
		<li>Mova o cursor para a imagem e clique em uma extremidade do fascicle que foi escolhido para ser medido. NOTA: Faça apenas medições em fascicles que todo o caminho do fascículo (ou seja, de uma aponeurose para a próxima aponeurose ou aponeurose ao tendão central) pode ser visto de forma convincente.</li>
		<li>Clique ao longo do caminho para garantir que a curvatura no caminho do fascículo seja capturada.</li>
		<li>Uma vez que o fim do caminho fascicle é alcançado, clique duas vezes para finalizar a linha e vá para Analisar | Meça para medir o comprimento da linha. NOTA: Uma nova janela, "Resultados", aparecerá na primeira vez que uma medição for feita. Quais valores são exibidos podem ser gerenciados na janela Resultados indo para resultados | Definir medidas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repetição de passos 3.4.3-3.4.5 até que várias medidas de fascículo sejam feitas em uma única imagem.</li>
	<li>Salve medições de fascicle clicando em | de arquivos Salvar na guia de resultados ou os valores podem ser copiados e colados em outro documento/planilha.</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Passos críticos no protocolo.
Existem alguns componentes críticos para obter imagens EFOV-US de qualidade que produzem medidas válidas e confiáveis de comprimento de fascicle. Em primeiro lugar, como indicado no método 1.1.2 é essencial que o sonografista tire tempo para se familiarizar com a anatomia do músculo que está sendo imageado, bem como músculos, ossos e outras estruturas de tecidos moles circundantes. Isso melhorará a capacidade do sonografista de imaginar ...

O comprimento do fascículo é um parâmetro importante da arquitetura muscular esquelética, que no geral é indicativo da capacidade de um músculo de produzir força1,2. Especificamente, o comprimento do fascículo de um músculo fornece uma visão sobre a amplitude absoluta de comprimentos sobre os quais um músculo pode gerar força ativa3,4. Por exemplo, dado dois músculos com valores idênticos para todos os parâmetros geradores de força isométrica (ou seja, comprimento médio de sarcomere, ângulo de pennação, área transversal fisiológica, estado de contração, etc.) exceto pelo comprimento da fascícula, o músculo com fascicles mais longo produziria sua força máxima em um comprimento mais longo e produziria força sobre uma faixa mais ampla de comprimentos do que o músculo com fascicles mais curtos3 . A quantificação do comprimento do fascículo muscular é importante para entender tanto a função muscular saudável quanto as alterações na capacidade de geração de força de um músculo, que pode ocorrer como resultado do uso muscular alterado (por exemplo, imobilização5,6, intervenção de exercício7,8,9, desgaste do salto alto10) ou uma mudança no ambiente do músculo (por exemplo, cirurgia de transferência de tendão11, distração do membro12 ). As medidas de comprimento do fascículo muscular foram originalmente obtidas através de experimentos ex vivo cadavéricos que permitem a medição direta de fascicles dissecados13,14,15,16. As informações valiosas fornecidas por esses experimentos ex vivo levaram ao interesse em implementar métodos in vivo17,18,19 para abordar questões que não puderam ser respondidas em cadáveres; métodos in vivo permitem quantificação de parâmetros musculares em um estado nativo, bem como em diferentes posturas articulares, diferentes estados de contração muscular, diferentes estados de carga ou descarga, e em populações com condições diferentes (ou seja, saudáveis/feridos, jovens/velhos, etc.). Mais frequentemente, o ultrassom é o método utilizado para a obtenção de comprimentos de fascículo muscular in vivo18,19,20; é mais rápido, menos caro e mais fácil de implementar do que outras técnicas de imagem, como a imagem do tensor de difusão (DTI)18,21.
O ultrassom de campo de visão estendido (EFOV-US) demonstrou ser um método válido e confiável para medir o comprimento do fascicle muscular in vivo. Embora comumente implementado, o ultrassom tradicional (T-US) tem um campo de visão que é limitado pelo comprimento da matriz do transdutor de ultrassom (tipicamente entre 4 e 6 cm, embora existam sondas que se estendem até 10 cm10)18,20. Para superar essa limitação, Weng et al. desenvolveram uma tecnologia EFOV-US que adquire automaticamente uma imagem "panorâmica" composta e bidimensional (até 60 cm de comprimento) de um scan dinâmico e de longa distância22. A imagem é criada por encaixar, em tempo real, uma sequência de imagens tradicionais de ultrassom no modo B, à medida que o transdutor digitaliza dinamicamente o objeto de interesse. Como as imagens sequenciais de T-US têm grandes regiões sobrepostas, as pequenas diferenças de uma imagem para outra podem ser usadas para calcular o movimento da sonda sem o uso de sensores de movimento externos. Uma vez calculado o movimento da sonda entre duas imagens consecutivas, a imagem "atual" é fundida sucessivamente com as imagens anteriores. O método EFOV-US permite a medição direta de fascicles musculares longos e curvos e tem sido demonstrado ser confiável entre músculos, ensaios e sonografistas23,24,25 e válido para superfícies planas e curvas23,26.
Implementar ultrassom para medir o comprimento da fascícula muscular in vivo não é trivial. Ao contrário de outras técnicas de imagem que envolvem protocolos mais automatizados (ou seja, ressonância magnética, tomografia computadorizada), o ultrassom depende da habilidade sonografista e do conhecimento anatômico27,28. Há preocupação de que o desalinhamento da sonda com o avião fascicle possa causar um erro substancial nas medidas de fascicle. Um estudo demonstra pouca diferença (em média < 3 mm) em medidas de comprimento de fascículo tomadas por ultrassom e ressonância magnética DTI, mas também mostra que a precisão de medição é baixa (desvio padrão de diferença ~12 mm)29. Ainda assim, foi demonstrado que um sonografista novato, com prática e orientação de um sonografista experiente, pode obter meaures válidos usando EFOV-US23. Assim, devem ser feitos esforços para demonstrar protocolos adequados para reduzir o erro humano e melhorar a precisão das medições obtidas usando o EFOV-US. Em última análise, o desenvolvimento e o compartilhamento de protocolos apropriados podem ampliar o número de experimentadores e laboratórios que podem reproduzir dados de comprimento de fascículo da literatura ou obter novos dados em músculos que ainda não foram estudados in vivo.
Neste protocolo, demonstramos como implementar o método EFOV-US para obter imagens musculoesqueléticos de alta qualidade que podem ser usadas para quantificar o comprimento do fascicle muscular. Especificamente, abordamos (a) a coleta de imagens EFOV-US de um único membro superior e um único músculo do membro inferior (b) determinando, em tempo real, a "qualidade" da imagem EFOV-US, e (c) quantificando parâmetros de arquitetura muscular offline. Fornecemos este guia detalhado para incentivar a adoção do método EFOV-US para a obtenção de dados de comprimento de fascículo muscular em músculos que não foram estudados in vivo devido aos seus longos fascicles.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>14L5 linear transducers</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10789396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acuson S2000 Ultrasound System</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10032746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable chair (Biodex System)</td>
			<td>Biodex Medical Systems</td>
			<td>System Pro 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin Marker Medium Tip</td>
			<td>SportSafe</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Multi-color 4 Pack recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound Gel - Standard 8 Ounce Non-Sterile Fragrance Free Glacial Tint</td>
			<td>MediChoice, Owens &#38;Minor</td>
			<td>M500812</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining quality extended field-of-view ultrasound images of skeletal muscle to measure muscle fascicle length

O comprimento da fascícula muscular, que é comumente medido in vivo usando ultrassom tradicional, é um parâmetro importante que define a capacidade de geração de força de um músculo. No entanto, mais de 90% de todos os músculos do membro superior e 85% de todos os músculos dos membros inferiores têm comprimentos de fascículo ótimos mais longos do que o campo de visão das sondas de ultrassom tradicional comum (T-US). Um método mais novo e menos frequentemente adotado chamado ultrassom de campo de visão estendido (EFOV-US) pode permitir a medição direta de fascicles por mais tempo do que o campo de visão de uma única imagem T-US. Este método, que se encaixa automaticamente em uma sequência de imagens T-US a partir de uma varredura dinâmica, foi demonstrado ser válido e confiável para a obtenção de comprimentos de fascículo muscular in vivo. Apesar dos numerosos músculos esqueléticos com fascicles longos e da validade do método EFOV-US para fazer medições de tais fascicles, poucos estudos publicados utilizaram esse método. Neste estudo, demonstramos tanto como implementar o método EFOV-US para obter imagens musculoesqueléticos de alta qualidade quanto como quantificar os comprimentos de fascícula dessas imagens. Esperamos que esta demonstração incentive o uso do método EFOV-EUA para aumentar o pool de músculos, tanto em populações saudáveis quanto deficientes, para as quais temos dados de comprimento de fascicle muscular in vivo.

O ultrassom de campo de visão estendido (EFOV-US) foi implementado para obter imagens da cabeça longa do bíceps brachii e da tibialis anterior em 4 voluntários saudáveis (Tabela 1). A Figura 1 mostra o que as imagens EFOV-US de ambos os músculos foram imagens nesta sessão de imagem representativa e destaca aspectos importantes de cada imagem, como aponeurose muscular, tendão central, caminho de fascículo, etc. Após o fim da sessão de imagem, foram analisadas 3 ima...

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Obtaining Quality Extended Field-of-View Ultrasound Images of Skeletal Muscle to Measure Muscle Fascicle Length

Este estudo descreve como obter imagens musculoesqueléticos de alta qualidade usando o método de ultrassom de campo de visão estendido (EFOV-US) com o propósito de fazer medidas de comprimento de fascícula muscular. Aplicamos este método a músculos com fascicles que se estendem além do campo de visão de sondas de ultrassom tradicional comum (T-US).

Obtenção de qualidade estendida campo de visão imagens de ultrassom do músculo esquelético para medir o comprimento do fascicle muscular

Muscle fascicle length, which is commonly measured in vivo using traditional ultrasound, is an important parameter defining a muscle&#8217;s force ...

obtaining-quality-extended-field-view-ultrasound-images-skeletal

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Medicine

Unit 1

The Muscular System

SCIENTISTS IN ACTION

3.5K visualizações.  Northwestern University. Este estudo descreve como obter imagens musculoesqueléticos de alta qualidade usando o método de ultrassom de campo de visão estendido (EFOV-US) com o propósito de fazer medidas de comprimento de fascícula muscular. Aplicamos este método a músculos com fascicles que se estendem além do campo de visão de sondas de ultrassom tradicional comum (T-US).

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Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

Myo-mecânico Análise do músculo esquelético isolado

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

Medicina

Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably adaptable to environmental factors1 such as hypertrophy by resistance exercise and atrophy by disuse. It thereby exhibits remodeling and adaptations to stressors (heat, ischemia, heavy metals, etc.)2,3. Damage can occur to muscle by a muscle exerting force while lengthening, the so-called eccentric contraction4. The contractile proteins can be damaged in such exertions and need to be repaired, degraded and/or resynthesized; these functions are not part of the contractile proteins, but of other much less abundant proteins in the cell. To determine what subset of proteins is involved in the amelioration of this type of damage, a global proteome must be established prior to exercise5 and then followed subsequent to the exercise to determine the differential protein expression and thereby highlight candidate proteins in the adaptations to damage and its repair. Furthermore, most studies of skeletal muscle have been conducted on the male of the species and hence may not be representative of female muscle. 
In this article we present a method for extracting proteins reproducibly from male and female muscles, and separating them by two-dimensional gel electrophoresis followed by high resolution digital imaging6. This provides a protocol for spots (and subsequently identified proteins) that show a statistically significant (p &lt; 0.05) two-fold increase or decrease, appear or disappear from the control state. These are then excised, digested with trypsin and separated by high-pressure liquid chromatography coupled to a mass spectrometer (LC/MS) for protein identification (LC/MS/MS)5. This methodology (Figure 1) can be used on many tissues with little to no modification (liver, brain, heart etc.).

A straight-forward set of methods to isolate and determine the identity of the most abundant proteins expressed in skeletal muscle. About 800 spots are discerned on a two-dimensional gel from 10 mg muscle; this allows for the determination of gender-specific protein expression. These methods will give equivalent results in most tissues.

Dimorfismo Sexo músculo esquelético de Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably ...

Method to Measure Tone of Axial and Proximal Muscle

The control of tonic muscular activity remains poorly understood. While abnormal tone is commonly assessed clinically by measuring the passive resistance of relaxed limbs1, no systems are available to study tonic muscle control in a natural, active state of antigravity support. We have developed a device (Twister) to study tonic regulation of axial and proximal muscles during active postural maintenance (i.e. postural tone). Twister rotates axial body regions relative to each other about the vertical axis during stance, so as to twist the neck, trunk or hip regions. This twisting imposes length changes on axial muscles without changing the body's relationship to gravity. Because Twister does not provide postural support, tone must be regulated to counteract gravitational torques. We quantify this tonic regulation by the restive torque to twisting, which reflects the state of all muscles undergoing length changes, as well as by electromyography of relevant muscles. Because tone is characterized by long-lasting low-level muscle activity, tonic control is studied with slow movements that produce "tonic" changes in muscle length, without evoking fast "phasic" responses. Twister can be reconfigured to study various aspects of muscle tone, such as co-contraction, tonic modulation to postural changes, tonic interactions across body segments, as well as perceptual thresholds to slow axial rotation. Twister can also be used to provide a quantitative measurement of the effects of disease on axial and proximal postural tone and assess the efficacy of intervention.

We have developed a device (Twister) to study the regulation of tonic muscle activity during active postural maintenance. Twister measures torsional resistance and muscular responses in standing subjects during twisting of the body axis. The device can be flexibly configured to study various aspects of tonic control across the neck, trunk, and/or hips.

Método para medir tom de músculo axial e proximal

The control of tonic muscular activity remains poorly understood.  While abnormal tone is commonly assessed clinically by measuring the passive resistance ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

High-throughput Citometria de Fluxo Ensaio Celular para detectar anticorpos em N-metil-D-aspartato ou dopamina-2 Receptor em Soro Humano

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly effective. This video describes the percutaneous biopsy technique using a modified Bergstr&#246;m needle to obtain skeletal muscle tissue samples from the vastus lateralis of human subjects. The Bergstr&#246;m needle consists of an outer cannula with a small opening (&#8216;window&#8217;) at the side of the tip and an inner trocar with a cutting blade at the distal end. Under local anesthesia and aseptic conditions, the needle is advanced into the skeletal muscle through an incision in the skin, subcutaneous tissue, and fascia. Next, suction is applied to the inner trocar, the outer trocar is pulled back, skeletal muscle tissue is drawn into the window of the outer cannula by the suction, and the inner trocar is rapidly closed, thus cutting or clipping the skeletal muscle tissue sample. The needle is rotated 90&#176;&#160;and another cut is made. This process may be repeated three more times. This multiple cutting technique typically produces a sample of 100-200 mg or more in healthy subjects and can be done immediately before, during, and after a bout of exercise or other intervention. Following post-biopsy dressing of the incision site, subjects typically resume their activities of daily living right away and can fully participate in vigorous physical activity within 48-72 hr. Subjects should avoid heavy resistance exercise for 48 hr to reduce the risk of herniation of the muscle through the incision in the fascia.

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&amp;#246;m Technique

The purpose of this video is to present the modified Bergstr&#246;m skeletal muscle biopsy technique on human subjects.

Procedimentos de biópsia de músculo esquelético humano, utilizando a técnica Bergström Modificado

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Quantitative Magnetic Resonance Imaging of Skeletal Muscle Disease

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of living systems. Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using qMRI methods. The MRI acquisition protocol begins with localizer images (used to locate the position of the body and tissue of interest within the MRI system), quality control measurements of relevant magnetic field distributions, and structural imaging for general anatomical characterization. The qMRI portion of the protocol includes measurements of the longitudinal and transverse relaxation time constants (T1 and T2, respectively). Also acquired are diffusion-tensor MRI data, in which water diffusivity is measured and used to infer pathological processes such as edema. Quantitative magnetization transfer imaging is used to characterize the relative tissue content of macromolecular and free water protons. Lastly, fat-water MRI methods are used to characterize fibro-adipose tissue replacement of muscle. In addition to describing the data acquisition and analysis procedures, this paper also discusses the potential problems associated with these methods, the analysis and interpretation of the data, MRI safety, and strategies for artifact reduction and protocol optimization.

Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using non-invasive magnetic resonance imaging methods.

Quantitativa Ressonância Magnética da doença do músculo esquelético

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of ...

Early Detection of Drug-Induced Renal Hemodynamic Dysfunction Using Sonographic Technology in Rats

The kidney normally functions to maintain hemodynamic homeostasis and is a major site of damage caused by drug toxicity. Drug-induced nephrotoxicity is estimated to contribute to 19- 25% of all clinical cases of acute kidney injury (AKI) in critically ill patients. AKI detection has historically relied on metrics such as serum creatinine (sCr) or blood urea nitrogen (BUN) which are demonstrably inadequate in full assessment of nephrotoxicity in the early phase of renal dysfunction. Currently, there is no robust diagnostic method to accurately detect hemodynamic alteration in the early phase of AKI while such alterations might actually precede the rise in serum biomarker levels. Such early detection can help clinicians make an accurate diagnosis and help in in decision making for therapeutic strategy. Rats were treated with Cisplatin to induce AKI. Nephrotoxicity was assessed for six days using high-frequency sonography, sCr measurement and upon histopathology of kidney. Hemodynamic evaluation using 2D and Color-Doppler images were used to serially study nephrotoxicity in rats, using the sonography. Our data showed successful drug-induced kidney injury in adult rats by histological examination. Color-Doppler based sonographic assessment of AKI indicated that resistive-index (RI) and pulsatile-index (PI) were increased in the treatment group; and peak-systolic velocity (mm/s), end-diastolic velocity (mm/s) and velocity-time integral (VTI, mm) were decreased in renal arteries in the same group. Importantly, these hemodynamic changes evaluated by sonography preceded the rise of sCr levels. Sonography-based indices such as RI or PI can thus be useful predictive markers of declining renal function in rodents. From our sonography-based observations in the kidneys of rats that underwent AKI, we showed that these noninvasive hemodynamic measurements may consider as an accurate, sensitive and robust method in detecting early stage kidney dysfunction. This study also underscores the importance of ethical issues associated with animal use in research.

Early stage hemodynamic dysfunction is critical to the development of kidney disease. Yet, detection methodologies are limited. Recent advances in sonography provide a noninvasive, accurate option for early detection of kidney injury. This study outlines a step-by-step, sonographic methodology for detecting kidney dysfunction using a drug-induced nephrotoxicity rat model.

Detecção precoce de Induzida por Medicamentos Renal hemodinâmica Disfunção Usando ultrassonografia Tecnologia em Ratos

The kidney normally functions to maintain hemodynamic homeostasis and is a major site of damage caused by drug toxicity. Drug-induced nephrotoxicity is ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow reserve (CFR) in humans. Reduced CFR is accompanied by marked intramyocardial and pericoronary fibrosis and is used as an indication of the severity of dysfunction. This study explores, step-by-step, the real-time changes measured in the coronary flow velocity, CFR and systolic to diastolic peak velocity (S/D) ratio in the setting of an aortic banding model in mice. By using a Doppler transthoracic imaging technique that yields reproducible and reliable data, the method assesses changes in flow in the septal coronary artery (SCA), for a period of over two weeks in mice, that previously either underwent aortic banding or thoracotomy. 
During imaging, hyperemia in all mice was induced by isoflurane, an anesthetic that increased coronary flow velocity when compared with resting flow. All images were acquired by a single imager. Two ratios, (1) CFR, the ratio between hyperemic and baseline flow velocities, and (2) systolic (S) to diastolic (D) flow were determined, using a proprietary software and by two independent observers. Importantly, the observed changes in coronary flow preceded LV dysfunction as evidenced by normal LV mass and fractional shortening (FS). 
The method was benchmarked against the current gold standard of coronary assessment, histopathology. The latter technique showed clear pathologic changes in the coronary artery in the form of peri-coronary fibrosis that correlated to the flow changes as assessed by echocardiography. 
The study underscores the value of using a non-invasive technique to monitor coronary circulation in mouse hearts. The method minimizes redundant use of research animals and demonstrates that advanced ultrasound-based indices, such as CFR and S/D ratios, can serve as viable diagnostic tools in a variety of investigational protocols including drug studies and the study of genetically modified strains.

Coronary flow reserve (CFR) is useful for assessment of myocardial oxygen demand and evaluation of cardiovascular risk. This study establishes a step-by-step transthoracic Doppler echocardiographic (TTDE) method for longitudinal monitoring of the changes in CFR, as measured from coronary artery in mice, under the experimental pressure overload of aortic banding.

Avaliação ultra-som base de Artéria Coronária Flow e Fluxo Coronariano Reserve Usando o modelo de sobrecarga de pressão no Mice

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and well tolerated technique. The Weil-Blakesley conchotome has a sharp biting tip with a 4 - 6 mm wide hollow. It is inserted through a 5 - 10 mm skin incision and can be maneuvered for controlled tissue penetration. The tip is opened and closed within the tissue and then rotated through 90 -180&#176; to cut the muscle. The amount of muscle obtained following repeated sampling can vary from 20 mg to 290 mg which can be processed for both histology and molecular studies. The wound needs to be kept dry and vigorous physical activity kept to a minimum for approximately 72 hr although normal levels of activity can restart immediately following the procedure. This procedure is safe and effective when close attention is paid to the selection of subjects, full asepsis and post procedure care. &#160;Both right and left vastus lateralis are suitable for biopsy dependent on participant preference.

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

This video demonstrates the technique of percutaneous muscle biopsy of the human vastus lateralis using the Weil-Blakesley conchotome.

Humano<em&gt; vasto lateral</em&gt; Biópsia de músculo esquelético Usando o Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

Induction and Assessment of Exertional Skeletal Muscle Damage in Humans

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery in humans. Herein we discuss the design of an eccentric exercise protocol to induce damage in the quadriceps muscles, marked by changes in strength, soreness, and plasma creatine kinase levels. This method is simple, ethical, and widely applicable since it is performed in human participants and eliminates the interspecies translation of the results. Subjects perform 300 maximal eccentric contractions of the knee extensor muscles at a speed of 120&#176;/sec on an isokinetic dynamometer. The extent of the damage is measurable using relatively non-invasive isokinetic and isometric measures of strength loss, soreness, and plasma creatine kinase levels over several days following the exercise. Therefore, its application can be directed to specific populations in an attempt to identify mechanisms for muscle adaptation and regeneration.

This article describes a safe and reliable method to induce and quantify exertional skeletal muscle damage in human subjects.

Indução e Avaliação da Exertional lesão muscular esquelético em humanos

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery ...