Name: studying tgf-β signaling and tgf-β-induced epithelial-to-mesenchymal transition in breast cancer and normal cells
Uploaded: 2020-10-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying TGF-ÃŽÂ² Signaling and TGF-ÃŽÂ²-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells at JoVE.com

Reconhecemos o apoio do Conselho de Bolsas Chinesa (CSC) ao J.Z. and Cancer Genomics Centre Netherlands (CGC). NL) para P.t.D.

1. Análise da fosforilação SMAD2 induzida por TGF-β usando manchas ocidentais
NOTA: As células mcf10A-ras de mama humana pré-maligna foram usadas como exemplo para investigar respostas de sinalização TGF-β33. Em princípio, os métodos descritos abaixo também são aplicáveis a outras linhas celulares com resposta à β TGF.
<ol><li>Cultura a linha de células epiteliais mamárias MCF10A-Ras a 37 °C no meio modificado da Águia (DMEM)/F12 de Dulbecco contendo L-glutamina com 5% de soro de cavalo, 20 ng/mL fator de crescimento epidérmico (EGF), insulina 10 mg/mL, 100 ng/mL enterotoxina, 0,5 mg/mL hidrocortisona e 1:100 penicilina-estreptomicina (Pen-Strep).</li>
	<li>Trippsinize células MCF10A-Ras com 1 mL de 0,25% de trypsin-EDTA por 1 minuto e conte células viáveis usando um contador de células.</li>
	<li>Células de sementes em placas de 6 poços a uma densidade de 5×105 células/bem.</li>
	<li>Após o crescimento noturno, trate as células com TGF-β (5 ng/mL) ou tampão de ligantes (4 mM HCl, 0,1% de albumina de soro bovino livre de ácido graxo (BSA) por 1 hora, e depois remova o meio de cultura e lave suavemente as células duas vezes com 1 mL de soro fisiológico tampão de fosfato (PBS).</li>
	<li>Células frias em placas de 6 poços no gelo e adicionam 150 μL de amortecedor de precipitação imunológica de rádio pré-cozido (RIPA) tampão de lise (150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,5% desoxicação de sódio, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8.0 e coquetel inibidor de mini protease recém-adicionado). Deixe a lise continuar no gelo por 10 minutos.</li>
	<li>Raspe as células aderentes do prato usando um raspador de células plásticas, em seguida, transfira suavemente a suspensão da célula para um tubo de microcentrifuge pré-cozido.</li>
	<li>Centrifugar a célula lysate por 10 minutos a 150 força centrífuga(x g) a 4 °C e transfira o supernante para um tubo de microcentrifuuge fresco de 1,5 mL.</li>
	<li>Meça a concentração de proteínas usando um kit de ensaio de proteína compatível com detergente (DC).</li>
	<li>Carregue 30 μg de proteína de cada amostra em um gel de gel de polifamese de sulfato de sulfato de sódio de 10% de sódio (SDS-PAGE) e execute o gel a uma tensão de 100 V por 1,5-2 horas.</li>
	<li>Transfira as proteínas do gel para uma membrana de difluoreto de polivinida de 45 μm (PVDF) a uma tensão de 110 V por 1-1,5 horas.</li>
	<li>Transfira a membrana PVDF para um recipiente apropriado com o lado da proteína (o lado que estava voltado para o gel) para cima, e enxágue brevemente a membrana em água destilada.</li>
	<li>Descarte a água, adicione a solução Ponceau S e coloque a membrana em uma plataforma de balanço por 1-2 minutos.</li>
	<li>Descalgue a membrana com água destilada enxaguando-a rapidamente e depois lavando-a por 1 minuto.</li>
	<li>Em seguida, coloque a membrana PVDF em uma caixa de luz, e tire uma foto para verificar se há cargas totais de proteínas iguais.</li>
	<li>Lave a membrana com soro fisiológico tris-tampão com Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl e 0,1% Tween 20) até que não haja coloração visível.</li>
	<li>Coloque a membrana no tampão de bloqueio (5% de leite desnatado na solução TBST) e incuba-a por 1 hora à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave a membrana duas vezes com TBST.</li>
	<li>Incubar a membrana com anticorpos primários contra fosfo-SMAD2 (p-SMAD2; 1:1000, caseiro 34), total SMAD2/3 1:1000 e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH; 1:1000), durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Lave a membrana duas vezes com TBST e incuba a membrana com um anticorpo secundário contra coelho ou rato (1:5000) por 2 horas.</li>
	<li>Incubar a membrana PVDF com substrato ECL ocidental por 30 segundos e detectar o sinal usando um sistema de imagem.</li>
	<li>Repita os experimentos pelo menos três vezes para obter triplicados biológicos.</li>
</ol>2. Análise das respostas transcricionais dependentes de SMAD3 induzidas pelo TGF-β
<ol><li>Realize o ensaio de repórter transcricional SMAD3/SMAD4 dependente da12-luciferase.<ol>
<li>Cultura e experimentpsinize células MCF10A-Ras como descrito no Passo 1. Células de sementes em placas de 24 poços a5×10 4 células/bem e permitem que as células aderam durante a noite.</li>
		<li>No dia seguinte à semeadura, cotransfeito as células em cada poço com 100 ng do TGF-β/SMAD3-indutível (CAGA)12 repórter transcricional de luciferase construem35 e 80 ng da construção de expressão β-galactosidase usando polietilenimina (PEI). A transfecção de β-galactosidase é usada para normalizar diferenças na eficiência de transfecção entre diferentes poços. Criar todos os grupos experimentais em triplicado.</li>
		<li>Após 24 horas de incubação, as células de fome com glicose DMEM sem soro e, 6 horas depois, adicionam TGF-β (5 ng/mL) ou tampão de ligantes (4 mM HCl, 0,1% BSA) como controle de veículo para as células.</li>
		<li>Depois de mais 24 horas de incubação, lave as células duas vezes com PBS pré-armado.</li>
		<li>Adicione 120 μL/bem 1× tampão de lise e agite suavemente a placa a 4 °C por 20 minutos.</li>
		<li>Transfira 30 μL de lise para cada poço de uma microplacão de ensaio branco de 96 poços para medir a atividade da luciferase usando um luminômetro.</li>
		<li>Transfira 50 μL de lise para cada poço de uma placa transparente de 96 poços para medir β-galactosidase.</li>
		<li>Normalize a atividade luciferase para a atividade β-galactosidase e repita os experimentos pelo menos três vezes para obter triplicados biológicos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analise a expressão de genes-alvo TGF-β usando reação quantitativa em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR).<ol>
<li>Cultura e experimentpsinize células MCF10A-Ras como descrito no Passo 1. Células de sementes em placas de 6 poços a5×10 5 células/bem e permitem que as células aderam durante a noite.</li>
		<li>Trate as células com TGF-β (5 ng/mL) ou tampão de ligantes (4 mM HCl, 0,1% BSA) por 6 horas e, em seguida, lave as células duas vezes com 1 mL de PBS.</li>
		<li>Isole o RNA total usando um kit de isolamento de RNA.</li>
		<li>Determine a concentração de RNA com um NanoDrop e realize a síntese de cDNA com 1 μg de RNA usando um kit de síntese cDNA de primeira linha.</li>
		<li>Use um sistema de detecção pcr em tempo real em tempo real para executar o PCR em tempo real quantitativo (qRT-PCR) com cDNA diluído dez vezes em uma mistura de reação de 10 μL que inclui primers humanos específicos para frente e para trás para GAPDH (para normalização), SERPINE1 (codificação da proteína PAI-1, um gene de destino TGF-β/SMAD), SMAD7 (gene alvo TGF-β/SMAD) e qPCR Master Mix. Criar todos os grupos experimentais em triplicado. NOTA: As sequências de primer usadas para detectar genes humanos de destino no qRT-PCR estão listadas na Tabela 1.</li>
		<li>Use as seguintes condições de reação qPCR: inicialização, 95 °C por 3 minutos; denaturação, 95 °C por 10 segundos; ressaring, 60 °C por 30 segundos; e extensão, 80 °C por 10 segundos; denaturação, ressarem e extensão são repetidas 40 vezes.</li>
		<li>Repita os experimentos pelo menos três vezes para obter triplicados biológicos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Análise do EMT induzido por β TGF
<ol><li>Analise a expressão dos marcadores EMT no nível da proteína usando manchas ocidentais. NOTA: A análise do EMT induzido por β TGF é mostrada usando células epiteliais NMuMG do mouse como exemplo36,37.<ol>
<li>Cultura NMuMG células a 37 °C em MEMEM-high glicose média suplementada com soro bovino fetal de 10% e 1:100 Pen-Strep. Use métodos descritos no Passo 1 para isolamento e detecção de proteínas. NOTA: Os seguintes anticorpos são usados neste experimento: E-cadherin, 1:1000; N-cadherin, 1:1000; Caracol, 1:1000; Lesma, 1:1000; Tubulin, 1:1000 (Figura 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analise a expressão dos marcadores EMT no nível mRNA usando PCR quantitativo em tempo real, conforme descrito na Etapa 2.2. NOTA: Todos os primers do mouse usados para qRT-PCR, incluindo CDH1 (codificação da proteína E-cadherin), SNAILe ZEB2 (Figura 3) estão listados na Tabela 1.</li>
	<li>Analise o processo EMT usando imunofluorescência indireta e coloração direta de fluorescência.<ol>
<li>Coloração indireta de imunofluorescência de E-cadherin<ol>
<li>Coloque tampas de vidro quadrada de 18 mm estéreis em placas de 6 poços (uma tampa por poço).</li>
			<li>Semente 1×105 células NMuMG com 2 mL de DMEM completo por placa de 6 poços e permitem que as células aderam durante a noite.</li>
			<li>Mova suavemente as tampas com células aderentes para uma nova placa de 6 poços e adicione 2 mL de cultura média aos poços.</li>
			<li>Trate as células com TGF-β (5 ng/mL) ou tampão de ligantes (4 mM HCl, 0,1% BSA) por 2 dias.</li>
			<li>Remova o meio de cultura e lave suavemente as células duas vezes com 1 mL de PBS pré-armado.</li>
			<li>Fixar as células adicionando 1 mL de paraformaldeído de 4% e incubando por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave suavemente as células duas vezes com 1 mL de PBS.</li>
			<li>Permeabilize as células fixas com 0,1% Triton X-100 por 10 minutos em temperatura ambiente e lave as células duas vezes com PBS.</li>
			<li>Bloqueie as células com 5% de BSA em PBS por 1 hora em temperatura ambiente e lave as células duas vezes com PBS.</li>
			<li>Adicione o anticorpo primário contra e-cadherina (diluído 1:1000 em PBS) ao topo de cada deslizamento de cobertura e incubar por 1 hora à temperatura ambiente.</li>
			<li>Remova o anticorpo primário e lave o deslizamento com PBS três vezes.</li>
			<li>Adicione o anticorpo secundário Alexa Fluor 555 (diluído 1:500 em PBS) ao topo de cada tampa e incubar por 1 hora à temperatura ambiente enquanto cobre com papel alumínio para proteger da luz.</li>
			<li>Remova o anticorpo secundário e lave o deslizamento com PBS três vezes.</li>
			<li>Monte o deslizamento (células voltadas para baixo) em lâminas de vidro usando meio de montagem com 4′,6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI) e armazene os slides montados em uma caixa a 4 °C, protegido da luz.</li>
			<li>Observe a coloração com microscopia confocal SP8.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Coloração de fluorescência direta de fisomante (F)-actin.<ol>
<li>Prepare amostras seguindo as etapas 3.3.1.1. para 3.3.1.9.</li>
			<li>Manche as células adicionando Alexa Fluor 488 Phalloidin (1:1000) por 1 hora à temperatura ambiente no escuro para visualizar o fistomante actin (F-actin).</li>
			<li>Lave as células três vezes com PBS.</li>
			<li>Monte a tampa em lâminas de vidro usando meio de montagem com DAPI e tire imagens com microscopia confocal SP8.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A sinalização TGF-β/SMAD desempenha um papel fundamental na progressão do câncer de mama, pois pode promover a invasão e a metástase celular do câncer de mama induzindo o EMT7. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho lógico para investigar a sinalização iniciada pelo TGF β desde a ativação SMAD induzida por receptores até respostas transcricionais e biológicas mediadas pelo SMAD. Começamos descrevendo a análise da fosforilação SMAD2, continuamos com respostas transcricionais dependentes de SMAD3 induzidas pelo TGF-β e expressão de marcadores emIT nos níveis genéticos e proteicos para analisar a resposta de sinalização TGF-β/SMAD, e finalmente examinou o EMT induzido pelo TGF β. Utilizamos o repórter transcricional12-luciferase contendo caixas derivadas do promotor PAI-1, para monitorar a atividade da via de sinalização TGF-β/SMAD35. Esta construção de repórter requer SMAD3 e SMAD4 para ativação. Estudos anteriores mostraram que o knockdown do SMAD4 atenuado a atividade12-luciferase induzida por TGF β 437. Além do ensaio do repórter, determinar o status de fosforilação de SMADs endógenos, incluindo SMAD2 e SMAD3, é outra maneira de investigar a resposta de sinalização TGF-β. De fato, outros membros da família TGF-β, como o fator de crescimento e diferenciação (GDF)-8/myostatina e GDF-9, também transduzem sinais via proteínaS SMAD2/3, engajando o TβRI42,43,44. Além do repórter12-luciferase, vários repórteres semelhantes têm sido usados para detectar a ativação da sinalização de TGF-β. Por exemplo, um repórter transcricional (SBE)4-Lux com elementos de resposta derivados do promotor junb pode ser eficientemente induzido por TGF-β, ativações e BMPs45.
Manchas ocidentais e qPCR foram usados para analisar o EMT induzido pelo TGF-β, que são métodos clássicos para investigar a expressão de marcadores epiteliais (ou seja, E-cadherin) e marcadores mesenquimais (ou seja, N-cadherin, Caracol, Lesma e Zeb2). Também foram realizadas colorações indiretas de imunofluorescência de E-cadherin e coloração direta de fluorescência de F-actin. Esses ensaios validaram ainda mais o fenótipo mesenquimal das células após o tratamento de TGF-β. A limitação da coloração da imunofluorescência é que as células precisam ser fixadas antes da incubação com anticorpos e imagens, e é difícil investigar mudanças na expressão do marcador DET em células vivas. Recentemente, o projeto de linhas celulares de repórteres emT, como adenocarcinoma-vimentin-RFP, tornou possível monitorar a transformação de células epiteliais para células mesenquimais em tempo real através da expressão de vísquia fluorescente vermelha (RFP) marcada. Esta plataforma poderia ser utilizada para triagem de medicamentos e desenvolvimento de novas drogas46. O corante LifeAct, um peptídeo de 17 aminoácidos, que pode manchar estruturas F-actin em células vivas, está se tornando uma ferramenta valiosa para visualizar o citoesqueleto actin em tempo real sem interferir nos processos celulares47. Neste estudo, foram utilizados dois inibidores de pequenas moléculas, SB431542 e GW788388, para validar seu efeito inibidor na sinalização de β TGF e no EMT induzido pelo TGF-β. Notavelmente, GW788388 inibe potentemente a atividade TβRI e TβRII, enquanto o SB431542 tem um efeito inibidor apenas no TβRI (e ALK4 e ALK7). Estudos anteriores revelaram que o GW788388 é mais potente in vivo do que o SB43154240. Além da inibição do EMT, a GW788388 reduziu a expressão de marcadores de fibrose no rim, e a administração oral de GW788388 em camundongos diabéticos diminuiu significativamente a glomerulopatia25,48.
O EMT desempenha um papel essencial na promoção da plasticidade celular do câncer e resulta na resistência a medicamentos e metástase 49. Portanto, o direcionamento de células derivadas do EMT com drogas citotóxica específicas50 ou induzindo a redifferentição através da transição mesenquimal-epitelial (MET)51 foi proposto como uma abordagem para superar a metástase celular do câncer e a resistência à terapia. No entanto, o MET contribui para a proliferação de células cancerígenas disseminadas em órgãos distantes52, o que pode ser contraproducente ao usar a reversão terapêutica do EMT. Recentemente, um novo estudo relatou uma abordagem de transdiferenciação terapêutica, visando diretamente as células cancerígenas de mama derivadas do EMT para diferenciação em adipócitos30. O estudo de Ishay-Ronen et. al.30 usaram células cancerígenas epiteliais de murina Py2T que haviam sido submetidas a uma transição para células mesenquimais em resposta ao tratamento de longo prazo com TGF-β. Eles demonstraram que rosiglitazone em combinação com inibidores MEK aumentou a diferenciação epitelial e a adipogênese. No entanto, descobrimos que a rosiglitazone por si só era suficiente para induzir a transdiferenteção de células murinas py2T mesenquimais em adipócitos.
Em resumo, os métodos utilizados neste estudo forneceram um fluxo de trabalho lógico para investigar a sinalização de β TGF e o EMT induzido pelo TGF-β. Os dois inibidores, SB431542 e GW788388, podem bloquear respostas induzidas pelo TGF-β e EMT. Além disso, também demonstramos que a rosiglitazone sozinha induz a adipogênese em certas células de câncer de mama mesenquimais induzidas por TGF β. Embora tenhamos usado apenas várias linhas de células cancerígenas de mama para investigar respostas de β TGF, os métodos descritos aqui poderiam ser extrapolados para outras células (câncer). Aqui, usamos várias concentrações de β TGF para induzir respostas celulares. Na maioria dos tipos de células, o TGF-β exerce sua atividade biológica na faixa de concentração de 0,01-10 ng/mL53 e induz a sinalização em um padrão de dose-resposta. Nas células endoteliais primárias, incluindo células endoteliais aórticas bovinas, TGF-β induziu a expressão substancial de SMAD2 fosforilado a 0,025 ng/mL, atingiu o máximo de 0,25 ng/mL, e permaneceu neste nível em resposta a concentrações mais elevadas53. Em nosso estudo, utilizamos uma alta concentração de TGF-β (5 ng/mL) em células MCF10A-Ras para o ensaio de repórter transcricional para obter respostas fortes. A fosforilação SMAD2 e a expressão genética alvo podem ser induzidas pelo TGF-β em uma dose baixa; assim, utilizamos 2,5 ng/mL TGF-β para tratar células. No entanto, a concentração de trabalho mais adequada depende do tipo celular e dos efeitos estimados. Para determinar a melhor concentração de TGF-β, recomenda-se tratar as células com diferentes doses (de baixo a alto).

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.
NMuMG cells are non-transformed epithelial breast cells established from a mouse mammary gland. NMuMG cells are frequently used as a model system to investigate TGF-&#946;-induced epithelial to mesenchymal transition (EMT). EMT is induced by TGF-&#946; in premalignant human MCF 10A-RAS (M2) cells and mouse MMTV-PyMT breast cancer cell line. The article has been updated to reflect this.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.

Erratum: Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

A citocina transformadora fator de crescimento-β (TGF-β) é o protótipo de um grande grupo de polipeptídeos regulatórios estrutural e funcionalmente relacionados, incluindo TGF-βs (ou seja, TGF-β1, -β2 e -β3), proteínas morfogênicas ósseas (BMPs) e ativações1,2. Todas essas citocinas desempenham papéis importantes no desenvolvimento embrionário e na manutenção da homeostase tecidual e órgão3. A desregulamentação incorreta do TGF-β pode levar a uma grande variedade de doenças, incluindo o câncer4,5. O TGF-β desempenha um papel complexo e duplo na progressão do câncer: nas células epiteliais normais e pré-malignas, o TGF-β se comporta como um supressor de tumor, inibindo a proliferação e induzindo apoptose6,7; no entanto, no estágio final da progressão do tumor, quando as respostas citostáticas são bloqueadas pela ativação de oncogenes ou perda de genes supressores tumorais, O TGF-β atua como um potencializador de tumores promovendo a transição epitelial-mesenquimal (EMT) em células cancerosas, permitindo assim a invasão de células cancerígenas e metástases, agindo sobre células no microambiente tumoral e estimulando a angiogênese e a evasão imunológica8,9,10.
O TGF-β é secretado como uma molécula precursora inativa contendo o terminal de carboxy-terminal maduro TGF-β e peptídeo associado à latência (LAP)11. Este pequeno complexo pode ser covalentemente ligado por proteína latente de ligação TGF-β (LTBP)12. A liberação de TGF-β maduros pode ser mediada pela ação de proteases específicas que cortam LAP ou pelo puxão mecânico de LAP em um processo dependente de integrin13,14. Além do LTBP, a Glicoproteína A repetições predominantes (GARP) é altamente expressa na superfície das células T regulatórias (Tregs) e desempenha um papel semelhante ao LTBP na regulação da ativação do TGF-β15,16. O GARP liga-se diretamente ao TGF-β latente através de linkagem de dissulfeto e associação não covalente. A ativação do TGF-β do complexo GARP/TGF-β requer integrins17. TGF-β maduro se liga aos receptores de quinase serina/threonina β TGF, ou seja, receptores TGF-β tipo I (TβRI) e TGF-β tipo II (TβRII)receptores 18 para iniciar a sinalização. A vinculação do TGF-β à TβRII promove o recrutamento de TβRI e a formação de um complexo heteromérico. Posteriormente, o TβRI é fosfoilado por TβRII quinase em resíduos de serina e threonina em um breve motivo glicina e serino-rico (GS), resultando em sua ativação19,20. Após a ativação, o TβRI ativado recruta e fosfolam seus substratos: os dois SMADs específicos do receptor (R-SMADs) que incluem SMAD2 e SMAD3(Figura 1). Os R-SMADs compartilham uma estrutura global semelhante com dois dos chamados domínios de homologia louca, MH1 e MH2, que são separados por uma região de linker rica em proline(Figura 2). O motivo de ligação de DNA dentro do domínio MH1 do SMAD3 não é conservado entre SMAD2 e SMAD3, e o SMAD2 não pode ligar diretamente o DNA por causa de duas inserções em seu domínio MH1 (exon 3 e L1). SMAD2 e SMAD3 podem ser ativados pela fosforilação do motivo SSXS em seu C-termini (Figura 2). O SMAD2/3 fosforilado forma complexos heteroméricos com um mediador SMAD comum, SMAD4, que se transloca para o núcleo para modular a transcrição de genes-alvo(Figura 1)7,21. Essa via de sinalização canônica do SMAD é precisamente regulada e gera respostas celulares e teciduais específicas, como a regulação do destino celular e da metástase celular tumoral e a invasão22. Além da sinalização TGF-β-SMAD, as vias de sinalização não-SMAD também podem ser ativadas diretamente por receptores para regular as respostas celulares a jusante23.
Durante a progressão do tumor, a ativação de vias dependentes de SMAD induzidas por TGF β e vias independentes de SMAD são necessárias para a indução do EMT. O EMT é um processo reversível no qual as células tumorais diferem de um fenótipo epitelial, que está associado à perda de contatos celulares-células e diminuição da polaridade apical-basal, a um fenótipo mesenquimal com motilidade aprimorada e capacidade de invasão24. O EMT é caracterizado pelo aumento da expressão de proteínas marcadores mesenquimais, incluindo N-cadherin, vimentina, Zeb2 e Snail1/2, e a regulação concomitante de marcadores epiteliais, como E-cadherin e β-catenin(Figura 3)25. No entanto, a transição de um epitelial para um estado mesenquimal é muitas vezes incompleta, e as células ganham características epiteliais e mesenquimais (E/M). Um artigo recente da Associação Internacional emIT propôs descrever o processo de células submetidas a estados fenotípicos intermediários de E/M como plasticidade epitelial-mesenquimal (EMP)26. Essa plasticidade refere-se a EMT parcial, um status híbrido de E/M, um estado emt metast, um contínuo EMT e um espectro EMT26. Durante o EMT, as células tumorais ganham propriedades de células-tronco cancerosas (CSC) e se tornam mais resistentes à apoptose induzida pelo descolamento27. Enquanto o EMT é responsável pela aquisição de um fenótipo invasivo em células tumorais primárias e impulsiona a progressão do câncer, em contraste, a transição mesenquimal-epitelial (MET) tem mostrado desempenhar um papel importante no crescimento das células tumorais disseminadas em locais metastáticos distantes28,29. Um estudo recente demonstrou que as células cancerígenas de mama derivadas do EMT podem ser transdiferenciadas em adipócitos, o que pode oferecer uma oportunidade para inibir a metástase e superar a resistência terapêutica em células tumorais e câncer recaído30. Devido ao importante papel da sinalização TGF-β na ativação do EMT na carcinogênese mamária, apresentamos protocolos detalhados para a mancha ocidental, um ensaio de repórter transcricional luciferase, reação quantitativa em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR) e imunofluorescência para a investigação de sinalização TGF-β, EMT induzido por TGF-β e a transdiferenciação de células tumorais de epiteliais mamárias hídrinas derivadas do EMT em adipóstos. Essas técnicas são as ferramentas analíticas mais utilizadas no campo da biologia celular. qRT-PCR é usado para detectar, caracterizar e quantificar os níveis de expressão mRNA de forma quantitativa. Em comparação com o PCR quantitativo (qPCR), uma técnica alternativa, a transcrição reversa (RT)-PCR pode ser usada para determinar a expressão mRNA de forma semi-quantitativa31,32. A mancha ocidental é usada para examinar níveis específicos de proteína em uma determinada amostra de lise celular com vantagens de sensibilidade e especificidade, de forma semi-quantitativa. Assim, apresentamos um fluxo de trabalho sistemático para analisar mudanças da expressão genética à expressão proteica para ajudar a investigar a sinalização TGF-β que também pode ser aplicada a outras vias de sinalização.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm-side square glass coverslips</td><td>Menzel Gl&amp;auml;ser</td><td>631-1331</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21422</td><td></td></tr><tr><td>Anti-E-cadherin antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td></td></tr><tr><td>anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) antibody</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB374</td><td></td></tr><tr><td>Anti-N-cadherin antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>610920</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Slug antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9585</td><td></td></tr><tr><td>anti-SMAD2/3 antibody</td><td>Becton Dickinson</td><td>610842</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Snail antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3879</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tubulin antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2148</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Cholera enterotoxin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate</td><td>Bio-Rad</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>DC protein assay kit</td><td>Bio-Rad</td><td>5000111</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-high glucose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-high glucose medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (DMEM)/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11039047</td><td></td></tr><tr><td>epidermal growth factor (EGF)</td><td>Merck Millipore</td><td>01-107</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>BioWest</td><td>S1860-500</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>PROMEGA</td><td>A600X</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0135</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA II kit</td><td>BIOKE&amp;acute;</td><td>740955</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine (PEI)</td><td>Polyscience</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td><td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1621</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>557366-M</td><td></td></tr><tr><td>Skimmed milk</td><td>Campina: Elk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Imaging System</td><td>Bio-Rad</td><td>17001402</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td>1855201</td><td></td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Perkin Elmer</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr></tbody></table>

studying tgf-&#946; signaling and tgf-&#946;-induced epithelial-to-mesenchymal transition in breast cancer and normal cells

Transformar o fator de crescimento β (TGF-β) é um fator multifuncional secreto que desempenha um papel fundamental na comunicação intercelular. Perturbações da sinalização de β TGF podem levar ao câncer de mama. TGF-β provoca seus efeitos na proliferação e diferenciação através de receptores TGF-β tipo I e tipo II da superfície celular específica (ou seja, TβRI e TβRII) que contêm um domínio de quinase serina/threonina intrínseca. Após a formação do complexo heteromérico induzido pelo TGF-β, o TβRI ativado provoca a sinalização intracelular por fosforilando SMAD2 e SMAD3. Estes SMADs ativados formam complexos heteroméricos com SMAD4 para regular genes alvo específicos, incluindo o inibidor de ativação de plasminogen 1 (PAI-1, codificado pelo gene SERPINE1). A indução da transição epitelial-mesenquimal (EMT) permite que células cancerígenas epiteliais no local primário ou durante a colonização em locais distantes obtenham um fenótipo invasivo e impulsionem a progressão do tumor. TGF-β atua como um potente indutor da invasão do câncer de mama dirigindo o EMT. Aqui, descrevemos métodos sistemáticos para investigar a sinalização de TGF-β e as respostas emt usando células epiteliais de MCF10A-RAS (M2) e células epiteliais NMuMG do mouse como exemplos. Descrevemos métodos para determinar a fosforilação SMAD2 induzida pelo TGF-β por mancha ocidental, atividade transcricional dependente de SMAD3/SMAD4 usando atividade de repórter luciferase e expressão genética alvo SERPINE1 por reação quantitativa em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR). Além disso, os métodos são descritos para examinar o EMT induzido pelo TGF-β, medindo alterações na morfologia, expressão do marcador epitelial e mesenquimal, coloração de actina de fisomante e coloração de imunofluorescência de E-cadherin. Duas pequenas moléculas seletivas inibidores de quinase receptora TGF-β, GW788388 e SB431542, foram usados para bloquear a fosforilação SMAD2 induzida pelo T β GF, genes-alvo e alterações na expressão do marcador EMT. Além disso, descrevemos a transdiferenteação das células tumorais epiteliais de mamina mesenquimal Py2T em adipócitos. Métodos para examinar a sinalização induzida pelo TGF-β e o EMT no câncer de mama podem contribuir para novas abordagens terapêuticas para o câncer de mama.

Análise da sinalização de TGF-β O passo chave na sinalização TGF-β é a fosforilação dos dois resíduos de serina terminal mais carboxy no motivo SSXS(Figura 2) por TβRI quinase38,39. Para investigar as respostas de sinalização do TGF-β, realizamos manchas ocidentais de SMAD2 fosforilado. Nas células de mama humana pré-maligna MCF10A-Ras, a fosforilação de SMAD2 aumentou significativamente em resposta à estimulação de β TGF por 1 hora, enquanto a expressão do total de SMAD2/3 não foi afetada pelo tratamento de β TGF(Figura 4A). Usando o ensaio de repórter transcricional CAGA-luc induzido pelo TGF β/4, descobrimos que o TGF-β induziu notavelmente o repórter da luciferase na linha de células MCF10A-Ras em comparação com células não tratadas(Figura 4B). Além disso, observamos que os alvos genéticos transcricionais bem caracterizados de TGF-β incluindo SMAD7 e SERPINE1 (codificação da proteína PAI-1), foram altamente expressos em células MCF10A-Ras tratadas pelo T β GF(Figura 4C).
Análise do EMT induzido por β TGF Avaliamos o EMT induzido pelo TGF β com vários métodos, como alterações morfológicas, a expressão de marcadores EMT nos níveis de mRNA e proteína e a coloração da imunofluorescência dos marcadores EMT36. As células epiteliais NMuMG tratadas com TGF-β por 1 e 2 dias mudaram de uma morfologia epitelial clássica para uma morfologia mesenquimal em forma de fuso, como mostrado pela microscopia de contraste de fase(Figura 5A). Consistente com as alterações morfológicas, observamos que o tratamento TGF-β levou a um aumento na expressão proteica de marcadores mesenquimais, incluindo N-cadherin, Caracol e Lesma37 (Figura 5B). Em contraste, a E-cadherina, um marcador epitelial, foi regulada em células NMuMG após 2 dias de tratamento de TGF-β(Figura 5B). Além disso, realizamos reação quantitativa em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR) para investigar a expressão genética dos marcadores EMT. O CDH1 (codificação da proteína E-cadherin) foi significativamente diminuído, enquanto marcadores mesenquimais como caracol e homeobox de dedo de zinco E-box-binding 2 (ZEB2) foram significativamente aumentados após a estimulação de TGF-β em células NMuMG em comparação com células não tratadas(Figura 5C). O EMT induzido por TGF-β em células NMuMG foi confirmado ainda pela coloração da imunofluorescência da e-cadherina. Após a estimulação TGF-β por 2 dias, as células NMuMG expressaram menos e-cadherina do que as células do grupo controle não induzido, conforme analisado pela microscopia confocal(Figura 5D). Além disso, as células NMuMG na presença de TGF-β formaram mais fibras de estresse actin, como mostra a microscopia confocal (Figura 5E).
SB431542 e GW788388 inibem sinalização TGF-β e EMT induzido por β TGF SB431542 é um inibidor competitivo da ATP do domínio quinase do TβRI, também chamado de quinase activina semelhante a receptor 5 (ALK5), enquanto GW788388 inibe a atividade de quinase TβRI e TβRII. Ambos os inibidores podem inibir a sinalização do receptor TGF-β40. Assim, tratamos células NMuMG com diferentes concentrações de GW788388 na presença de TGF-β por 1 hora. Como esperado, GW788388 inibiu a fosforilação SMAD2 induzida por TGF β de forma dependente de dose(Figura 6A). Além disso, a fosforilação mediada por TGF-β de SMAD2 foi bloqueada pelo tratamento SB431542(Figura 6A). O SMAD2/3 fosforilado forma um complexo heteromérico com SMAD4 e se transloca para o núcleo para modular a transcrição dos genes-alvo. Por isso, investigamos a translocação de células SMAD2/3 em NMuMG por coloração de imunofluorescência de SMAD2/3. Os dados demonstraram que tanto o SB431542 quanto o GW788388 inibiram significativamente a translocação nuclear induzida pelo TGF-β e o acúmulo de células SMAD2/3 em células NMuMG(Figura 6B). Além disso, os efeitos inibitórios de SB431542 e GW788388 também foram observados nos níveis de expressão mRNA de importantes genes-alvo TGF-β envolvidos no EMT, incluindo PAI-1, SNAIL, E-cadherin e Fibronectin (Figura 6C). Esses dados sugeriram que o SB431542 e o GW788388 bloquearam a sinalização TGF-β e o EMT induzido pelo TGF-β.
Análise da transdiferenteção de células mesenquimais de câncer de mama em adipócitos O EMT desempenha um papel vital no aumento da plasticidade celular nos cânceres e resulta no desenvolvimento da resistência terapêutica. A plasticidade celular cancerígena pode ser diretamente direcionada e inibida com uma abordagem trans-diferenciação, como a adipogênese forçada30. Utilizamos células cancerígenas de mama de py2T, que eram derivadas da glândula mamária de um vírus mamário de camundongos vírus-polioma médio tumor-antígeno (MMTV-PyMT) transgênico, como um modelo celular de plasticidade celular induzida pelo EMT. Com base em um protocolo estabelecido41,tratamos células cancerígenas de mama py2T derivadas do EMT com a droga anti-diabética rosiglitazone por 10 dias para induzir adipogênese. A adipogênese foi avaliada pela visualização de gotículas lipídicas utilizando manchas vermelhas de óleo O. As células de gordura foram prontamente detectadas em células cancerígenas de mama py2T tratadas com rosiglitazone(Figura 7),que demonstraram que o tratamento apenas com rosiglitazone é suficiente para promover a transdiferenciação de células cancerígenas de mama derivadas do EMT em adipócitos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig01.jpg"> Figura 1: Sinalização TGF-β/SMAD. A sinalização TGF-β inicia-se com a vinculação de TGF-β ao receptor TGF-β tipo II (TβRII), uma quinase constitutivamente ativa, que fosforila TGF-β receptor tipo I (TβRI). Em seguida, ativado TβRI kinase fosforilatos SMAD2/3. Um peptídeo contendo o motivo SSXS de SMAD2 com dois resíduos de serina terminal carboxy foi usado para obter antisera policlonal reconhecendo fosforr-SMAD2 (p-SMAD2). Portanto, a análise da expressão p-SMAD2 por manchas ocidentais pode ser usada para determinar a ativação da via de sinalização TGF-β. O SMAD2/3 fosforilado pode formar complexos heteroméricos com SMAD4, que então se translocam para o núcleo para modular respostas transcricionais. O ensaio de repórter12-luciferase e o PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) para a expressão mRNA de genes-alvo TGF-β, como SMAD7 e SERPINE1 (codificação de proteína PAI-1), podem ser usados para analisar respostas transcricionais dependentes de SMAD3 induzidas por TGF-β. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig02.jpg"> Figura 2: Estrutura esquemática de R-SMADs (SMAD2 e SMAD3). Os domínios MH1 (azul) e MH2 (amarelo) são conservados entre R-SMADs, mas a região do linker (cinza) não é conservada. O domínio MH1 do SMAD3 abriga um motivo de ligação de DNA, enquanto o SMAD2 não pode ligar diretamente o DNA, por causa de uma inserção (exon 3) em seu domínio MH1. O domínio MH2 media a oligomerização do SMAD, interação com receptores TGF-β e vinculação de proteínas e está envolvido na regulação transcricional. SMAD2 e SMAD3 podem ser ativados pela fosforilação do motivo SSXS (em vermelho) em seu termini C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig03.jpg"> Figura 3: Emt induzido por β TGF. Durante a transição epitelial-mesenquimal induzida pelo TGF-β (EMT), as células sofrem perda de epiteliais e aquisição de características mesenquimais com maior motilidade celular e capacidade de invasão. A indução do EMT leva à expressão de marcadores mesenquimais como N-cadherin, Zeb2 e Snail1/2, bem como a baixa regulação de marcadores epiteliais, incluindo E-cadherin, β-catenin e claudin-1. A perda acumulada ou o ganho das características epiteliais/mesenquimais (E/M) faz com que uma célula entre em estados intermediários de forma reversível. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig04.jpg"> Figura 4: Respostas de sinalização TGF-β em células MCF10A-Ras. ( A )Ascélulas MCF10A-Ras foram tratadas com ou sem TGF-β (2,5 ng/mL) por 1 hora, e as células foram imunovaladas para SMAD2 fosforilado (p-SMAD2), total SMAD2/3 e GAPDH (como controle de carga). O marcador de tamanho é mostrado à direita. Contra: Grupo de controle sem tratamento TGF-β. (B) Análise da atividade transcritória TGF-β (5 ng/mL) utilizando o repórter transcricional12-luciferase (LUC) dependente de SMAD3-SMAD4 nas células MCF10A-Ras. Os valores são normalizados para atividade β-galactosidase (βGal). Os dados são expressos como a média ± s.d,n = 3. Teste t do aluno, ***P ≤ 0,001(C)qRT-PCR análise dos genes-alvo TGF-β SMAD7 e SERPINE1 (codificação da proteína PAI-1) em células MCF10A-Ras tratadas com TGF-β (2,5 ng/mL) por 6 horas. GAPDH foi usado como controle interno. Os dados são expressos como a média ± s.d,n = 3. Teste do aluno, ***P ≤ 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig05.jpg"> Figura 5: EMT induzido por β TGF em células NMuMG. (A) Morfologia das células NMuMG tratadas com TGF-β (2,5 ng/mL) por 1 ou 2 dias. Na presença de TGF-β, as células NMuMG transdiferenciadas em um fenótipo mesenquimal. Barra de escala = 150 μm (B) As células NMuMG foram tratadas com ou sem TGF-β (5 ng/mL) por 2 dias, e os marcadores EMT foram analisados por manchas ocidentais. O marcador de tamanho é como indicado à direita. Contra: Grupo de controle sem tratamento TGF-β. (C) Análise da expressão genética dos marcadores EMT(CDH1 (codificação da proteína E-cadherin), SNAIL e ZEB2) em células NMuMG tratadas por 2 dias com TGF-β (5 ng/mL). GAPDH foi usado como controle interno. Os resultados são expressos como a média ± s.d., n = 3. Teste t do aluno, *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001. (D) As células NMuMG foram manchadas por imunofluorescência para detectar a expressão do marcador epitelial E-cadherin (vermelho) após tgf-β (2,5 ng/mL) tratamento por 2 dias. Os núcleos foram contra-identificados com DAPI (azul). As imagens foram capturadas com microscopia confocal. Barra de escala = 50 μm(E) As células NMuMG foram manchadas com fluoresceína-fhalloidina (verde) para visualizar f-actina. Os núcleos foram contra-identificados com DAPI (azul). Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig06.jpg"> Figura 6: TGF-βsignaling e TGF-β induzido EMT foram inibidos por SB431542 e GW788388. ( A )Ascélulas NMuMG foram tratadas com 10 μM de SB431542 (SB) ou as concentrações indicadas de GW788388 (GW) na presença ou ausência de TGF-β (5 ng/mL) durante 1 hora. Os lysatos celulares foram imunoblottados para p-SMAD2, SMAD2/3 e GAPDH. (B) As células NMuMG foram tratadas com 5 μM de SB431542 (SB) ou 10 μM de GW788388 (GW) na presença ou ausência de 5 ng/mL de TGF-β por 1 hora e imunofluorescência manchada para detectar a translocação nuclear de SMAD2/3 (verde). As imagens foram capturadas com microscopia confocal. (C) A expressão de genes alvos TGF-β, incluindo PAI-1 e genes codificando marcadores EMT, incluindo SNAIL, E-Cadherin e Fibronectin, foram analisados por reação de cadeia de polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) em células NMuMG após tratamento SB ou GW e estimulação TGF-β por 48 horas. GAPDH serviu como um controle de carregamento. O controle denota células não tratadas. Esta figura foi modificada de Petersen M. et al. 34 com permissão do editor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig07.jpg"> Figura 7: Células cancerígenas de mamárias py2T derivadas do EMT podem ser induzidas a se diferenciar em adipócitos. As células cancerígenas de mama murina py2T foram estimuladas com 2 ng/mL TGF-β por 20 dias para induzir o EMT completo. Em seguida, as células foram tratadas com DMSO como controle de veículo ou rosiglitazone (2 μM) por 10 dias para permitir a diferenciação de células cancerígenas mesenquimais e induzir adipogênese. O meio era trocado a cada 2 dias. Após 10 dias de tratamento, as células foram manchadas com óleo vermelho O. Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig07large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>espécie</td>
			<td>Nome genético</td>
			<td colspan="2">Para a frente (5' a 3')</td>
			<td colspan="2">Reverso (5' a 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">humano</td>
			<td>GAPDH</td>
			<td colspan="2">TGCACCACCAACTGCTTAGC</td>
			<td colspan="2">GGCATGGACTGTGGTCATGAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SMAD7</td>
			<td colspan="2">TCCAGATGCTGTGCCTTCC</td>
			<td colspan="2">GTCCGAATTGAGCTGTCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SERPINE1</td>
			<td colspan="2">CACAAATCAGACGGCAGCACT</td>
			<td colspan="2">CATCGGGCGTGGTGAACTC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">rato</td>
			<td>GAPDH</td>
			<td colspan="2">TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC</td>
			<td colspan="2">AAGATGGTGATGGGCTTCCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>CDH1</td>
			<td colspan="2">ACCAAAGTGACGCTGAAGTC</td>
			<td colspan="2">GAGGATGTACTTGGCAATGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>caracol</td>
			<td colspan="2">CAGCTGGCCAGGCTCGGT</td>
			<td colspan="2">GCGAGGGCCTCCGGAGCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZEB2</td>
			<td colspan="2">TTCTGCAAGCCTCTGTAGCC</td>
			<td colspan="2">TTCTGGCCCCATTGCATCAT</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Primers usados para qRT-PCR.

Watch this Scientific Journal Video about Studying TGF-ÃŽÂ² Signaling and TGF-ÃŽÂ²-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells at JoVE.com

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Descrevemos um fluxo de trabalho sistemático para investigar a sinalização TGF-β e o EMT induzido pelo TGF β, estudando a proteína e a expressão genética envolvidas nessa via de sinalização. Os métodos incluem mancha ocidental, ensaio de repórter de luciferase, qPCR e coloração de imunofluorescência.

Estudando a sinalização TGF-β e a transição epitelial-mesenquimal induzida pelo TGF-β em câncer de mama e células normais

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Cancer Research

12.7K visualizações.  Leiden University Medical Center. Descrevemos um fluxo de trabalho sistemático para investigar a sinalização TGF-β e o EMT induzido pelo TGF β, estudando a proteína e a expressão genética envolvidas nessa via de sinalização. Os métodos incluem mancha ocidental, ensaio de repórter de luciferase, qPCR e coloração de imunofluorescência.

Vídeo: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Ensaio esferóide para TGF-β Medida induzida Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Medicina

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor &#946;, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor &#945;. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

Desenvolvimento de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensaio para avaliar contrátil Função de células mesenquimais que a transição epitelial-mesenquimal Sofreu

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Biologia do Desenvolvimento

Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic plasticity drives invasion, dissemination and metastasis. Indeed, while most of the studies of phenotypic plasticity have been in the context of epithelial-derived carcinomas, it turns out sarcomas, which are mesenchymal in origin, also exhibit phenotypic plasticity, with a subset of sarcomas undergoing a phenomenon that resembles a mesenchymal-epithelial transition (MET). Here, we developed a method comprising the miR-200 family and grainyhead-like 2 (GRHL2) to mimic this MET-like phenomenon observed in sarcoma patient samples.We sequentially express GRHL2 and the miR-200 family using cell transduction and transfection, respectively, to better understand the molecular underpinnings of these phenotypic transitions in sarcoma cells. Sarcoma cells expressing miR-200s and GRHL2 demonstrated enhanced epithelial characteristics in cell morphology and alteration of epithelial and mesenchymal biomarkers. Future studies using these methods can be used to better understand the phenotypic consequences of MET-like processes on sarcoma cells, such as migration, invasion, metastatic propensity, and therapy resistance.

We present here a cell culture method for inducing mesenchymal-epithelial transitions (MET) in sarcoma cells based on combined ectopic expression of microRNA-200 family members and grainyhead-like 2 (GRHL2). This method is suitable for better understanding the biological impact of phenotypic plasticity on cancer aggressiveness and treatments.

A indução de transições mesenquimais-epiteliais em células de sarcoma

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic ...

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction of differentiation of two mouse breast epithelial cell lines, HC11 and EpH4, and their use to study complementary stages of mammary gland development and neoplastic transformation.
The HC11 mouse breast epithelial cell line originated from the mammary gland of a pregnant Balb/c mouse. It differentiates when grown to confluence attached to a plastic Petri dish surface in medium containing fetal calf serum and Hydrocortisone, Insulin and Prolactin (HIP medium). Under these conditions, HC11 cells produce the milk proteins &#946;-casein and whey acidic protein (WAP), similar to lactating mammary epithelial cells, and form rudimentary mammary gland-like structures termed &#34;domes&#34;.
The EpH4 cell line was derived from spontaneously immortalized mouse mammary gland epithelial cells isolated from a pregnant Balb/c mouse. Unlike HC11, EpH4 cells can fully differentiate into spheroids (also called mammospheres) when cultured under three-dimensional (3D) growth conditions in HIP medium. Cells are trypsinized, suspended in a 20% matrix consisting of a mixture of extracellular matrix proteins produced by Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma cells, plated on top of a layer of concentrated matrix coating a plastic Petri dish or multiwell plate, and covered with a layer of 10% matrix-containing HIP medium. Under these conditions, EpH4 cells form hollow spheroids that exhibit apical-basal polarity, a hollow lumen, and produce &#946;-casein and WAP.
Using these techniques, our results demonstrated that the intensity of the cadherin/Rac signal is critical for the differentiation of HC11 cells. While Rac1 is necessary for differentiation and low levels of activated RacV12 increase differentiation, high RacV12 levels block differentiation while inducing neoplasia. In contrast, EpH4 cells represent an earlier stage in mammary epithelial differentiation, which is inhibited by even low levels of RacV12.

We describe techniques for differentiation induction of two breast epithelial lines, HC11 and EpH4. While both require fetal calf serum, insulin, and prolactin to produce milk proteins, EpH4 cells can fully differentiate into mammospheres in three-dimensional culture. These complementary models are useful for signal transduction studies of differentiation and neoplasia.

Diferenciação das células Epiteliais do Peito do Camundongo HC11 e EpH4

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Pesquisa do câncer

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the actual molecules towards which the cells migrate remain elusive. This modified invasion assay has been developed to identify targets which drive cell migration and invasion. This technique compares the invasion index under three conditions to determine whether a specific hormone, growth factor, or cytokine plays a role in mediating the invasive potential of a cancer cell. These conditions include i) normal fetal bovine serum (FBS), ii) charcoal-stripped FBS (CS-FBS), which removes hormones, growth factors, and cytokines and iii) CS-FBS + molecule (denoted &#8220;X&#8221;). A significant change in cell invasion with CS-FBS as compared to FBS, indicates the involvement of hormones, cytokines or growth factors in mediating the change. Individual molecules can then be added back to CS-FBS to assay their ability to reverse or rescue the invasion phenotype. Furthermore, two or more factors can be combined to evaluate the additive or synergistic effects of multiple molecules in driving or inhibiting invasion. Overall, this method enables the investigator to determine whether hormones, cytokines, and/or growth factors play a role in cell invasion by serving as chemoattractants or inhibitors of invasion for a particular type of cancer cell or a specific mutant. By identifying specific chemoattractants and inhibitors, this modified invasion assay may help to elucidate signaling pathways that direct cancer cell invasion.

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

A modificação<em&gt; In vitro</em&gt; Invasion Ensaio para determinar o possível papel dos hormônios, citocinas e / ou fatores de crescimento na Cancer Mediating Invasion celular

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and mechanical stability, and represents a core element of multi-cellular animal life. In adherent cells, acto-myosin contraction is seen in traction forces that cells exert on their substrate. Dysregulation of cellular contractility appears in a myriad of pathologies, making contractility a promising target in diverse diagnostic approaches using biophysics as a metric. Moreover, novel therapeutic strategies can be based on correcting the apparent malfunction of cell contractility. These applications,&#160;however, require direct quantification of these forces.
We have developed silicone elastomer-based traction force microscopy (TFM) in a parallelized multi-well format. Our use of a silicone rubber, specifically polydimethylsiloxane (PDMS), rather than the commonly employed hydrogel polyacrylamide (PAA) enables us to make robust and inert substrates with indefinite shelf-lives requiring no specialized storage conditions. Unlike pillar-PDMS based approaches that have a modulus in the GPa range, the PDMS used here is very compliant, ranging from approximately 0.4 kPa to 100 kPa. We create a high-throughput platform for TFM by partitioning these large monolithic substrates spatially into biochemically independent wells, creating a multi-well platform for traction force screening that is compatible with existing multi-well systems.
In this manuscript, we use this multi-well traction force system to examine the Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT); we induce EMT in NMuMG cells by exposing them to TGF-&#946;, and to quantify the biophysical changes during EMT. We measure the contractility as a function of concentration and duration of TGF-&#946; exposure. Our findings here demonstrate the utility of parallelized TFM in the context of disease biophysics.

We present a high throughput traction force assay fabricated with silicone rubber (PDMS). This novel assay is suitable for studying physical changes in cell contractility during various biological and biomedical processes and diseases. We demonstrate this method's utility by measuring a TGF-&#946; dependent increase in contractility during the epithelial-to-mesenchymal transition.

Microscopia de força de tração de alta produtividade usando PDMS revela efeitos dose-dependentes do fator de crescimento transformador-β na transição epitelial-para-mesenquimal

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Bioengenharia

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Biologia

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Detecção de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal Transição

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with organ fibrosis. In these conditions, differentiated endothelial cells acquire mesenchymal-like phenotypes. This process is called endothelial-mesenchymal transition (EndMT) and is characterized by downregulation of endothelial markers, upregulation of mesenchymal markers, and morphological changes. EndMT is induced by several signaling pathways, including transforming growth factor (TGF)-&#946;, Wnt, and Notch, and regulated by molecular mechanisms similar to those of epithelial-mesenchymal transition (EMT) important for gastrulation, tissue fibrosis, and cancer metastasis. Understanding the mechanisms of EndMT is important to develop diagnostic and therapeutic approaches targeting EndMT. Robust induction of EndMT in vitro is useful to characterize common gene expression signatures, identify druggable molecular mechanisms, and screen for modulators of EndMT. Here, we describe an in vitro method for induction of EndMT. MS-1 mouse pancreatic microvascular endothelial cells undergo EndMT after prolonged exposure to TGF-&#946; and show upregulation of mesenchymal markers and morphological changes as well as induction of multiple inflammatory chemokines and cytokines. Methods for the analysis of microRNA (miRNA) modulation are also included. These methods provide a platform to investigate mechanisms underlying EndMT and the contribution of miRNAs to EndMT.

A protocol for in vitro induction of endothelial-mesenchymal transition (EndMT), which is useful for investigating cellular signaling pathways involved in EndMT, is described. In this experimental model, EndMT is induced by treatment with TGF-&#946; in MS-1 endothelial cells.

Análise molecular de transição endotelial-mesenquimais induzida por transformar o fator de crescimento-β sinalização

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like phenotype, a process that is termed endothelial to mesenchymal transition (EndMT). Emerging results have suggested that EndMT is causally linked to multiple human diseases, such as fibrosis and cancer. In addition, endothelial-derived mesenchymal cells may be applied in tissue regeneration procedures, as they can be further differentiated into various cell types (e.g., osteoblasts and chondrocytes). Thus, the selective manipulation of EndMT may have clinical potential. Like epithelial-mesenchymal transition (EMT), EndMT can be strongly induced by the secreted cytokine transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), which stimulates the expression of so-called EndMT transcription factors (EndMT-TFs), including Snail and Slug. These EndMT-TFs then up- and downregulate the levels of mesenchymal and endothelial proteins, respectively. Here, we describe methods to investigate TGF-&#946;-induced EndMT in vitro, including a protocol to study the role of particular TFs in TGF-&#946;-induced EndMT. Using these techniques, we provide evidence that TGF-&#946;2 stimulates EndMT in murine pancreatic microvascular endothelial cells (MS-1 cells), and that the genetic depletion of Snail using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-mediated gene editing, abrogates this phenomenon. This approach may serve as a model to interrogate potential modulators of endothelial biology, and can be used to perform genetic or pharmacological screens in order to identify novel regulators of EndMT, with potential application in human disease.

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

We describe methods to investigate TGF-&#946;2-induced EndMT in endothelial cells by observing cell morphology changes and examining the expression EndMT-related marker changes using immunofluorescence staining. CRISPR/Cas9 gene editing was described and used to deplete the gene encoding Snail to investigate its role in TGF-&#946;2-induced EndMT.

Endotelial mediado por TGF-β para transição mesenquimal (EndMT) e a avaliação funcional dos efeitos endMT usando edição de genes CRISPR/Cas9

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

Estudando a sinalização TGF-β e a transição epitelial-mesenquimal induzida pelo TGF-β em câncer de mama e células normais

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo